水稻叶特异表达基因及苹果酸脱氢酶基因的克隆和功能分析

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为了研究水稻叶组织特异基因及其表达,利用抑制消减杂交法(SSH)建立了水稻叶对根的差减文库。经筛选,获得171个差异克隆。其插入片段分别输入GenBank中进行同源搜索,发现其中水稻中已克隆基因有85个,未克隆的功能基因有45个,未知基因片段有41个。它们涉及水稻光合作用、代谢、膜运输、信号传导以及抗病性等生理活动。利用SSH分离得到的片段。我们分别克隆了水稻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蔗糖转化酶(invertase)及Lon蛋白酶等基因的全长cDNA,并对它们的基因组序列及功能进行了初步研究。同源性搜索发现Ospepc与植物许多已知的PEPC具有很高的同源性(84%-86%),它还含有许多PEPC特异的保守功能域。定量PCR分析证实Ospepc在叶中的表达明显强于在根中的表达。对Osinv的同源性搜索发现它与植物其它中性/碱性转化酶也具有较高的同源性(71%-80%)。RT-PCR分析,结果发现Osinv在叶中增强表达,而且盐处理和低温处理会提高它的表达水平。Oslon推测编码水稻线粒体Lon蛋白酶,可特异降解线粒体中的异常蛋白质。同源性搜索显示该蛋白质与其它Lon蛋白酶具有较高的同源性(77%-92%),Conserved Domain Search分析它具有Lon蛋白酶的保守功能域。Northern杂交分析证实Oslon在叶中增强表达。分析还发现该基因在不育系珍汕97A的生殖器官(幼穗和花药)中存在可变剪接,RNA原位杂交初步显示该可变剪接可能发生在绒毡层中,可能与细胞质雄性不育有关。原核表达显示该基因可正常翻译出符合推测分子量的蛋白质。另外,基因组搜索表明它还存在两个同源基因。此外,我们通过筛选水稻幼苗cDNA文库分别克隆到细胞质和线粒体苹果酸脱氢酶基因。以Actin基因为内对照进行RT-PCR分析发现二者组织表达模式较为一致,在幼穗和未成熟胚中表达较高,而在叶和根中较低。原核表达证实二者都能编码与预期大小相符的蛋白质。进一步的检测表明OscMDH具有苹果酸脱氢酶活性。
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