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目的:我们前期研究发现,肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞之间存在由Cx43组成的缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC),并介导NSCLC的恶性进展,但CAFs能否通过该GJIC与NSCLC细胞形成代谢耦联从而发挥代谢调控作用,仍不清楚。因此,本研究探索CAFs对NSCLC的代谢调控作用及分子机制。方法:1、采用组织贴壁法分离、培养原代CAFs、正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs),并通过形态学以及免疫印迹法(western blot,WB)和免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测成纤维细胞标记物的表达进行鉴定。2、按照CAFs:NSCLCL细胞=5:1的比例进行混合,接种至新培养瓶中,构建直接共培养体系。3、采用试剂盒分别检测单独培养与共培养后CAFs的葡萄糖摄取、乳酸分泌水平、糖酵解关键酶M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)、乳酸脱氢酶-A(lactate dehydrogenase isoform A,LDH-A)活性,即糖酵解水平。4、采用试剂盒分别检测单独培养与共培养后NSCLC细胞的葡萄糖摄取、乳酸分泌水平、乳酸脱氢酶-B(lactate dehydrogenase B,LDH-B)活性、丙酮酸、乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A,acetyl-CoA)、柠檬酸、α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)和ATP水平,即氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)水平。5、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测82例NSCLC组织和配对癌旁组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Cx43、LDH-B的表达,分析其与NSCLC临床病理因素的关系、用Kaplan–Meier法进行生存分析、用单因素和多因素Cox比例风险模型评估其与NSCLC患者预后的关系。结果:1、光学显微镜下可见,NFs、CAFs形态相似、呈梭状、胞体较大、胞核呈卵圆形、胞质丰富;WB和IF结果显示,CAFs与NFs均表达间叶性标记物vimentin,同时均不表达上皮性标记物E-cadherin;相比配对的NFs,CAFs明显高表达成纤维细胞标记物α-SMA和FAP-α,且差异具有统计学意义(p<0.05)。2、光学显微镜下可见,直接共培养的CAFs与NSCLC细胞融合度达90%以上,表明我们成功构建了CAFs与NSCLC细胞直接共培养体系。3、试剂盒检测结果表明,相比单独培养的CAFs,共培养后CAFs的葡萄糖摄取、乳酸分泌水平、PKM2、LDH-A活性明显增高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。4、试剂盒检测结果表明,相比单独培养的NSCLC细胞,共培养后NSCLC细胞的葡萄糖摄取、乳酸分泌水平明显降低,同时LDH-B活性、丙酮酸、acetyl-CoA、柠檬酸、α-KG、ATP水平明显增加,且差异具有统计学意义(p<0.05)。5、试剂盒检测结果表明,在CAFs和NSCLC细胞上共同干扰Cx43,使GJIC缺失,则共培养后NSCLC细胞的OXPHOS明显减弱;即使用糖酵解激活剂1,6-二磷酸果糖(fructose-1,6-bisphosphate,FBP)预处理CAFs,亦无法逆转共培养后NSCLC细胞的OXPHOS减弱;反之,使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-d-glucose,2-DG)预处理CAFs,可进一步减弱共培养后NSCLC细胞OXPHOS。另一方面,在CAFs和NSCLC细胞上共同过表达Cx43,使GJIC增强,则共培养后NSCLC细胞的OXPHOS明显增强,糖酵解抑制剂2-DG可部分拮抗共培养后NSCLC细胞的OXPHOS增强;反之,糖酵解增强剂FBP可进一步增强共培养后NSCLC细胞的OXPHOS,且差异具有统计学意义(p<0.05)。6、IHC结果显示,相比配对的癌旁组织,α-SMA、Cx43、LDH-B在NSCLC组织中明显高表达,且α-SMA主要在肿瘤基质中表达,Cx43主要在肿瘤基质和肿瘤细胞交界处表达,LDH-B主要在肿瘤细胞中表达。α-SMA、或Cx43、或LDH-B的单独高表达与高TNM分期和临床转移明显相关;α-SMA和Cx43、或Cx43和LDH-B二者共同高表达均与高TNM分期明显相关;α-SMA、Cx43和LDH-B三者共同高表达与高TNM分期、临床转移明显相关,且具有统计学意义(p<0.05)。7、生存分析表明,α-SMA、或Cx43、或LDH-B的单独高表达、或α-SMA和Cx43、或Cx43和LDH-B、或α-SMA和LDH-B二者共同高表达或α-SMA、Cx43和LDH-B三者共同高表达均明显缩短NSCLC患者总生存期(overall survival,OS)和无复发生存期(relapse free survival,RFS);单因素和多因素Cox回归分析发现,仅α-SMA、Cx43和LDH-B三者共同高表达可作为NSCLC的独立预后因素,且具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、NSCLC能诱导CAFs发生有氧糖酵解。2、有氧糖酵解的CAFs通过Cx43组成的GJIC增强NSCLC的OXPOHS,实现糖代谢重编程。3、α-SMA、或Cx43、或LDH-B单独高表达与NSCLC临床转移和高TNM分期相关;α-SMA和Cx43、或LDH-B和Cx43二者共同高表达与高TNM分期相关;Cx43、α-SMA、LDH-B三者共同高表达与NSCLC临床转移和高TNM分期相关;α-SMA、Cx43、LDH-B三者共同表达可作为NSCLC的独立预后因素。