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研究背景及目的:随着早期筛查手段的普及,生活方式的改变及生活压力的增大,我国癌症确诊年龄不断提前。2020年《中国生活质量白皮书》数据显示,包括胃癌、宫颈癌、结直肠癌、肾癌等癌症在内的年轻患者（15-39岁）比例呈上升趋势。与此同时,随着社会的发展和生育理念的改变,我国女性平均生育年龄缓慢延后,晚婚晚育变得越来越普遍。因此,女性恶性肿瘤患者卵巢内分泌及生育功能的保护问题受到人们越来越多的关注。顺铂作为一种广谱抗癌药,能抑制肿瘤细胞DNA复制和转录,可用于头颈部鳞癌、淋巴肉瘤、卵巢癌和宫颈癌等恶性肿瘤的治疗。然而,其发挥抗癌作用的同时伴随着对正常机体的毒性作用,如肾毒性、消化道毒性、耳毒性、心脏毒性和卵巢毒性等。顺铂可以损伤卵巢的内分泌功能,导致女性性激素分泌紊乱,LH、E2、P水平降低,FSH水平升高;同时其可造成卵巢原始卵泡减少,储备功能下降,窦状卵泡数量减少伴随血清AMH水平降低,进而导致女性生育能力下降甚至不孕。近年来,人们越来越重视使用天然产物（例如黄酮类化合物,尤其是槲皮素）来治疗疾病。槲皮素作为一种天然化合物,传统上已被用于预防或治疗多种疾病,包括癌症,心血管疾病,多囊卵巢综合症（PCOS）,肥胖症,慢性炎症和生殖系统功能障碍等。研究表明,槲皮素作为抗凋亡、抗氧化剂可对多种器官损伤起到保护作用。近些年,自然-通讯（Nature communication）杂志发表多篇文章揭示槲皮素在抗衰老及治疗衰老相关退行性疾病中的显著作用。已有体内及体外实验证明,槲皮素和顺铂在卵巢癌和宫颈癌的治疗中具有协同抑癌作用,但联用槲皮素对顺铂所致正常卵巢功能受损的作用尚不清楚。手术和以顺铂为基础的化疗是保证早期卵巢癌和宫颈癌患者能保留生育功能的两架马车,此外,包括化疗药物在内的外来毒物损伤是导致早发性卵巢功能不全（POI）的重要原因。然而,目前研究发现的具有抑制原始卵泡过度激活作用的药物尚匮乏,如何减轻外来物质对卵巢造成的损伤并保存卵巢储备功能成为临床医生迫切需要解决的问题。因此,建立顺铂致雌性小鼠卵巢功能受损模型,探究槲皮素对顺铂诱导卵巢功能损伤的保护机制,对探索在顺铂治疗可保留生育功能的妇科癌症患者时或卵巢受到其他毒物损伤时,把槲皮素作为卵巢保护剂并预防早发性卵巢功能不全具有理论意义和临床指导价值。研究方法:文献报道,对雌性小鼠腹腔注射1.5mg/kg的顺铂15天可导致卵巢功能受损,此累计人体等效剂量接近临床顺铂常用化疗剂量75mg/m~2,而又不会导致小鼠不孕。因此,本研究中通过对7周龄雌性ICR小鼠每天1次、持续15天的顺铂腹腔注射来构建顺铂致雌性小鼠卵巢损伤模型。另据文献报道,使用100mg/kg槲皮素可以对小鼠脊髓、肝脏、肺脏等多种组织损伤起到保护作用。故本研究分为四组:对照（Control）组（生理盐水）、槲皮素（Que）组（100mg/kg）、顺铂（Cis）组（1.5mg/kg）、联合用药（Cis+Que）组（槲皮素100mg/kg+顺铂1.5mg/kg）,并通过四部分研究,探讨了顺铂对卵巢造成损伤后,槲皮素对卵巢的保护作用及初步机制。第一部分槲皮素减少顺铂导致的卵泡损失:观察小鼠的一般情况,如体重、卵巢重量和进食量来评估药物对小鼠健康情况的影响;荧光Tunel及免疫组织化学（IHC）检测Cleaved-Caspase 3观察各组凋亡情况;IHC法检测PCNA蛋白表达观察各组增殖情况;通过对卵巢组织的HE染色,观察卵巢组织的形态变化;卵泡计数观察各组卵泡数量变化;第二部分槲皮素减轻顺铂对小鼠卵巢功能的损伤:观察小鼠动情周期,并检测小鼠血清性激素水平来评估药物对小鼠卵巢内分泌功能的影响;通过检测血清AMH及记录小鼠交配实验结果来评估药物对小鼠卵巢生殖功能的影响;第三部分小鼠卵巢蛋白非标记（4D-Label Free）定量检测:通过最新4D-Label Free蛋白质组学对小鼠卵巢蛋白质进行定量检测,寻找差异蛋白以初步探究两种药物对卵巢影响;第四部分初步探究槲皮素减轻顺铂所致卵巢损伤的机制:对小鼠卵巢的氧化应激水平进行检测,并通过免疫印迹（WB）检测凋亡相关的蛋白（活化Caspase 3、Bax、Bcl-2）及始基卵泡激活相关蛋白的表达（p-PTEN/PTEN、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR、p-Foxo3a/Foxo3a、p-rp S6/rp S6）来评估药物对各实验组凋亡水平及PI3K/PTEN/Akt卵泡激活相关信号通路影响。研究结果:（1）与对照组小鼠相比,顺铂组小鼠进食减少,体重及卵巢重量减轻,联用槲皮素减轻了顺铂毒性,使小鼠进食量、体重及卵巢重量均较单用顺铂组增加;（2）顺铂组卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡活化增殖较对照组增加,槲皮素能够降低顺铂诱导的凋亡及卵泡活化;（3）顺铂造成小鼠卵巢原始卵泡计数减少,卵巢储备功能降低,初级卵泡增多,窦状卵泡减少,联合用药组原始卵泡及窦状卵泡均较顺铂组增加;（4）顺铂组小鼠动情周期停滞在动情间期,血清雌激素水平下降,卵泡刺激素分泌增加,联用槲皮素增加了小鼠动情期频率,升高血清雌激素水平并降低卵泡刺激素水平;（5）在第一轮交配实验中,顺铂组小鼠产仔的间隔时间较对照组小鼠延长,但第二轮及第三轮小鼠产仔间隔时间无统计学差异。顺铂组雌性小鼠抗苗勒管激素表达水平降低,产仔量下降,联合用药组小鼠血清抗苗勒管激素水平及产仔量较顺铂组升高;（6）顺铂组与对照组差异蛋白富集于对活性氧的反应、活性氧代谢过程的调节、小分子代谢过程、代谢过程、细胞外结构组织、发展过程、生物黏附、细胞增殖、生物粘附等生物过程;顺铂联用槲皮素后,差异蛋白可富集于抗氧化活性过程,蛋白质定量检测还发现联合用药组凋亡蛋白相比顺铂组降低,而抗凋亡蛋白相比顺铂组升高,与此同时,PI3K/AKT信号通路中重要的负性调节因子PTEN升高;（7）槲皮素提高了小鼠卵巢抗氧化应激基因表达水平,降低了顺铂诱导的卵巢凋亡蛋白水平,并增加抗凋亡蛋白的表达,同时减少了顺铂诱导的PI3K/PTEN/AKT卵泡激活信号通路中关键蛋白的磷酸化。研究结论:（1）本研究构建了动物实验模型,槲皮素能够减轻顺铂诱导的小鼠卵巢损伤;（2）槲皮素减弱顺铂诱导的凋亡,抑制原始卵泡激活,从而减少了原始卵泡和窦状卵泡丢失,增加了卵巢的储备功能;（3）槲皮素改善了因顺铂受损的小鼠卵巢内分泌功能和生殖功能;（4）蛋白质定量检测提示,槲皮素可能通过调控卵巢中氧化应激、细胞凋亡、及PI3K/AKT信号通路发挥作用;（5）PCR及WB验证结果表明,槲皮素通过提高卵巢抗氧化应激基因表达,降低卵巢细胞凋亡蛋白表达,升高抗凋亡蛋白表达水平并抑制卵泡激活相关的PI3K/PTEN/Akt信号通路来减弱顺铂对卵巢的毒性。