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将轮状病毒(Rotavirus)VP6亚单位基因插入原核表达载体pGEX-KG中,获得了重组质粒pGEX-VP6。经IPTG诱导,在大肠杆菌中高水平表达了GST(谷胱苷肽转移酶)与VP6的融合蛋白。通过GST亲和层析、凝血酶切割和凝胶过滤纯化,获得了高纯度的VP6蛋白。免疫家兔,制备了VP6的高效价特异性多克隆兔抗血清。 以甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)侵染性克隆为基础,用经植物偏好型密码子修饰的VP6基因(sVP6)替代BBSV的外壳蛋白(CP)基因。其体外转录产物用于机械接种BBSV的枯斑寄主苋色藜。接种后4-10天,提取发病叶片的总RNA及蛋白,利用RT-PCR或Western blotting方法对sVP6的RNA转录和蛋白表达情况进行检测。在此基础上,利用间接ELISA的方法对不同批次接种叶片中VP6蛋白的表达量进行了测定,数据统计结果表明,发病苋色藜叶片中,VP6蛋白的含量平均值可达植物总可溶性蛋白的0.25%。 分别采集苋色藜健康叶片和接种表达VP6的叶片,粗提取并浓缩叶片中总可溶性蛋白,辅以CpG免疫佐剂灌胃免疫6-8周龄的BALB/c母鼠。初免后的7周中,对小鼠的唾液、粪便及肠道粘膜IgA及血清IgG进行了间接或双抗夹心ELISA的检测。结果表明,与对照组小鼠相比,处理组小鼠无论粘膜IgA还是体液IgG均显示出明显的抗体发生趋势。 用猿轮状病毒SA-11株对受免母鼠所产乳鼠进行攻毒实验,结果表明,在相同的攻毒剂量下,与对照组相比,免疫组母鼠所产小鼠在攻毒后几天中致病率明显下降,腹泻症状较轻且症状持续时间相对缩短。这些研究结果表明,被免疫母鼠体内由VP6亚单位植物食用疫苗所产生的非中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供异源交叉保护。 同时,成功构建了含轮状病毒VP6亚单位基因的植物双元表达载体pBVP6和pBinBB-sVP6。以分别含有这两种表达载体的农杆菌EHA101进行了甜菜转化,并对甜菜再生苗的外源基因整合情况进行了PCR、PCR-Southern和Southern blotting分析。 以上结果为利用植物作为生物反应器,通过稳定表达或瞬时表达方式生产轮状病毒的可食用疫苗提供了新的技术途径和材料基础。