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目的:探讨蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质水平及mRNA表达的影响,揭示蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇降低血浆胆固醇作用的分子机制;比较蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HMG-CoA还原酶蛋白质水平和mRNA表达的影响,明确蜂蜡素降低血浆胆固醇的主要有效成分,为蜂蜡素原料提取工艺改革和组分优化提供依据。
方法:1.应用MTT法检测蜂蜡素的主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG2细胞存活能力的影响,确定三十烷醇和二十八烷醇不影响HepG2细胞存活能力,可用于二药降低血浆胆固醇作用机制研究的剂量。
2.应用WesternBlot检测HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质水平,图像分析系统检测HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质的积分光密度,通过积分光密度值判断不同浓度蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质水平的影响。
3.应用RT-PCR技术检测HepG2细胞HMG-CoA还原酶mRNA的表达,图像分析系统检测HMG-CoA还原酶mRNA的积分光密度,通过积分光密度值判断不同浓度蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG2细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响。
资料统计应用PEMS3.1统计分析软件。数据以样本均数士标准差表示。统计学差异采用t检验分析,P<0.05表示两组差别有显著意义;P<0.01表示两组差别有非常显著意义。
结果:1.在细胞存活能力实验中,当三十烷醇和二十八烷醇浓度为125μg·ml-1或以下时,对细胞存活能力无影响,为试验研究可选择的剂量范围。
2.WesternBlot实验结果显示,随着蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇(三药的剂量均为:8×10-1、8×100、8×101μg·ml-1)浓度升高,HMG-CoA还原酶蛋白质水平逐渐降低,有明显的剂量依赖关系。三药抑制HMG-CoA还原酶蛋白质的IC50值虽然不同,但三药95%可信限的范围相互之间有重叠,因此,可以认为三药作用强度基本相同。
3.RT-PCR实验结果显示,随着蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇浓度的升高,HMG-CoA还原酶mRNA的表达逐渐降低,有明显的剂量依赖关系。三药抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达的IC50值虽然不同,但三药95%可信限的范围相互之间有重叠,因此,可以认为三药作用强度基本相同。
4.WesternBlot和RT-PCR两实验结果相似,显示蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇抑制HMG-CoA还原酶蛋白质水平和mRNA的作用强度具有同步性。
结论:1.蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇可抑制HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质水平,即抑制HMG-CoA还原酶活性。
2.蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇可抑制HepG2细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达,提示其从mRNA转录水平影响HMG-CoA还原酶蛋白质合成,而降低该酶的活性。
3.三十烷醇和二十八烷醇抑制HepG2细胞HMG-CoA还原酶蛋白质和mRNA的作用强度与蜂蜡素基本相似,两药虽然是蜂蜡素降低血浆胆固醇的主要有效成分,但单个有效成分未见明显优于复合组分。