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第一部分美洲大蠊提取物对大鼠溃疡性结肠炎肠道菌群的影响目的:探讨美洲大蠊提取物YS-1、YS-2的不同配比对异体抗原结合醋酸诱导的溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型肠道菌群的影响。方法:将美洲大蠊提取物YS-1、YS-2的以不同配比制成YS-ABC三种药剂,给予异体抗原结合醋酸诱导的UC大鼠进行治疗;根据细菌种属特异性DNA序列设计PCR引物,构建出含有特异性扩增片段的重组质粒作为标准品,建立基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR检测方法,对UC模型组大鼠及给药治疗后的大鼠粪便样本进行拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、肠球菌、硫酸盐还原菌等菌群的含量检测,以绝对定量和菌群占比两种方法进行统计分析。结果:1.建立了肠道细菌总菌群、拟杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、大肠埃希菌(种)、肠球菌属、硫酸盐还原菌的荧光定量PCR检测方法。2. UC模型组大鼠粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌(4.13±0.28、4.48±0.32, lg菌拷贝数,下同)相较于正常对照组(4.92±0.30、5.13±0.67)显著减少(P<0.05);大肠埃希菌、肠球菌(3.14±0.46、2.16±0.35)相较正常对照组(3.76±0.54、2.40±0.39)有减少趋势;拟杆菌、硫酸盐还原菌(5.75±0.38、4.22±0.18)相较于正常对照组(5.46±0.25、3.77±0.2])有增加趋势;肠道菌群总量(7.05±0.13)相较于正常对照组(7.02±0.15)没有显著差异。3.经给药治疗后,YS-A (YS-1/YS-2 为 2:1)、YS-C (YS-1/YS-2 为1:2) .各剂量组及YS-B (YS-1/YS-2为1:1)中、高剂量组双歧杆菌数量较模型组有一定程度增加。模型组和各给药组双歧杆菌占比较正常组均显著下降(P<0.05,P<0.01) ; YS-ABC各剂量组较模型组双歧杆菌均有不同程度增加的趋势。4.YS-B低剂量组乳酸杆菌数量较模型组显著增加(P<0.01) ; SASP组,YS-A中、高剂量组,YS-B中剂量组及YS-C低剂量组乳酸杆菌数量将模型组有增加趋势;YS-B高剂量组乳酸杆菌数量较其他组有降低趋势。5.YS-B中、高剂量组拟杆菌数量相较于模型组显著降低(P<0.05),柳氮磺吡啶(SASP)、YS-C低剂量组拟杆菌数量较模型组有降低趋势。YS-A中剂量拟杆菌占比较正常组显著上升。6. YS-B低、中剂量组及YS-C中、高剂量组大肠埃希菌较模型组有显著升高(P<0.05) ; SASP组,YS-C低剂量组大肠埃希菌较模型组普遍有升高趋势。7. YS-A低、中剂量组肠球菌相较于各组有下降趋势;其余各组肠球菌数量及比例较模型组均有一定程度增加。8. YS-A、YS-B各剂量组较模型组均能显著降低硫酸盐还原菌数量(P<0.05、P<0.01),SASP、YS-C各剂量组硫酸盐还原菌数量较模型组均有下降趋势。9.YS-A中剂量肠道总菌群数量较正常组和模型组均显著下降(P<0.05);其余各组差异不明显。10.各样本中菌群占比结构变化结果与绝对定量法分析基本一致。结论:1.本研究采用重组质粒的SYBR Green Ⅰ绝对荧光定量PCR法,建立6种与UC密切相关的肠道菌及总菌群的荧光定量PCR方法,对UC模型组及药物治疗组大鼠粪便中6种优势菌进行定量分析是可行的。2.异体抗原结合醋酸诱导的UC大鼠模型肠道菌群明显失衡;双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、肠球菌数量较正常对照明显减少,拟杆菌、硫酸盐还原菌数量较正常对照明显增多,UC模型组大鼠粪便中总菌群数量基本维持恒定;肠道各菌群的相对占比变化与绝对定量结果分析基本一致。3.本实验中YS-A、YS-B、YS-C三种药物均能在一定程度上调节UC大鼠肠道微生态环境,平衡肠道菌群,有助于临床治疗UC新药的开发。第二部分昆虫源提取物抗肿瘤活性机制初步研究目的:对昆虫源提取物进行体外抗肿瘤活性筛选并对其抗肿瘤活性提取物进行初步的作用研究。方法:将350个昆虫提取物分别作用于三株人肿瘤细胞48 h(人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株Bel-7402),采用MTT法检测细胞增殖抑制情况并计算IC50值,对具有深入研究价值的样品进一步确定其量效、时效关系;流式细胞术对昆虫提取物抑制肿瘤细胞增殖的机制进行初步研究,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡及坏死;PI单染色法检测细胞周期分布;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化。结果:1.从350个昆虫不同提取物中筛选出对A549、Hela、Bel-7402细胞全部或部分具有较好细胞毒活性的受试样品31个。其中,10个样品对A549细胞具有较好增殖抑制活性,10个样品对Hela细胞具有较好增殖抑制活性,22个样品对Bel-7402细胞具有较好增殖抑制活性。2.选取对三株人肿瘤细胞均具有较好增殖抑制作用的样品YS-122,进行进一步的时效及量效关系研究。药物作用24、48、72 h时,YS-122对Hela、A549、Bel-7402细胞均有较好的抑制作用,并且具有一定剂量依赖性。Hela细胞株72h的 IC50 值为 4.96 μg/mL;A549 细胞株 48、72h的IC50 值分别为 31.64、6.93 μg/mL;Bel-7402 细胞株 48、72h的IC50 值分别为 32.72、4.06 μg/mL。3. Annexin V-FITC/PI双染色法检测样品YS-122对三株人肿瘤细胞诱导凋亡及坏死的影响。不同浓度的样品YS-122作用于肿瘤细胞后,凋亡早期、凋亡晚期及坏死早期、坏死晚期细胞比例与阴性对照组相比呈上升趋势,差异具有统计学意义。其中,YS-122以相同浓度作用于Hela细胞24、48h,凋亡早期、凋亡晚期及坏死早期、坏死晚期细胞比例变化不大,作用72 h时,凋亡晚期及坏死早期细胞比例升高明显。4. PI单染色法检测样品YS-122对三株人肿瘤细胞细胞周期分布的影响。不同浓度的样品YS-122作用于肿瘤细胞24、48、72 h后,细胞周期中Sub (G0/G1)峰、G0/G1峰、S峰、G2/M峰、S+G2/M所占比例与阴性对照组相比差异显著。相同作用时间下,随着YS-122浓度增加,Sub (Go/G1)峰、S峰所占比例升高,G0/G1峰所占比例降低,差异具有统计意义(p<0.01)。5. JC-1染色法检测样品YS-122对三株人肿瘤细胞线粒体膜电位的影响。不同浓度的样品YS-122作用于肿瘤细胞48 h后,各细胞线粒体膜电位呈下降趋势,与阴性对照组相比差异显著(P<0.01)。结论:1.从350个昆虫不同提取物中筛选出具有较好细胞毒活性的受试样品31个。2.样品YS-122对三株人肿瘤细胞均具有较好的增殖抑制作用(以顺铂为阳性对照),并且具有良好的时间依赖性及剂量依赖性。3.样品YS-122可能是通过激活线粒体途径凋亡信号,刺激肿瘤细胞周期阻滞于S期,阻断癌细胞由S期向G2/M期的进程,阻滞细胞的有丝分裂并促使G1期细胞凋亡,进而降低了肿瘤细胞的增殖活性。