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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)是眼镜蛇蛇毒中的一类小分子蛋白质,其氨基酸序列与cystatinM具有高度相似性,具有抗肿瘤侵袭转移作用的潜能。实验室前期的研究提示sv-cystain可能是具有多作用靶点的抗肿瘤侵袭转移候选新药。本研究在前期研究的基础上,建立稳定的sv-cystain重组蛋白制备工艺,获得高纯度高活性的sv-cystain重组蛋白,探讨其体内外抗肿瘤侵袭转移作用及分子机制,为临床前研究和产业化开发提供理论依据。1蛇毒cystatin在巴斯德毕赤酵母系统中的表达、分离与纯化为了全面评价sv-cystatin抗肿瘤侵袭转移作用,需要获得高产量的、高纯度的、高活性的sv-cystatin重组蛋白,运用优化的巴斯德毕赤酵母表达系统生产sv-cystatin重组蛋白,经IMAC和超滤离心浓缩脱盐方法进行纯化,分析其抑制木瓜蛋白酶的活性,结果如下:GS115-cystatin表达上清中sv-cystatin重组蛋白产量达18 mg/L,经纯化后其纯度达95.08%、产量为5 mg/L、分子量约为14KDa;计算重组蛋白的抑制常数(Ki)为2.67 nM,具有较强的抑制活性。2蛇毒cystatin重组蛋白抗肿瘤侵袭转移作用应用改良Boyden小室分析法、C57BL/6小鼠黑色素瘤实验性肺转移实验及BALB/cA-nude裸鼠人肝癌MHCC97H细胞自发性肺转移实验模型,进一步全面评价sv-cystatin重组蛋白体内外抗肿瘤侵袭转移作用,结果如下:5种浓度的重组蛋白体外处理B16F10细胞后,穿越重建基底膜的能力明显降低(P<0.01),侵袭抑制率分别是:17.05%、27.13%、31.01%、37.98%和47.29%;除了10μg/ml低剂量组外其它4组MHCC97H细胞的侵袭能力明显降低(P<0.01),侵袭抑制率分别是:19.7%、21.21%、30.3%和40.91%;低、中两个剂量对C57BL/6小鼠B16F10细胞实验性肺转移的转移抑制率分别是34.90%、41.58%(P<0.01);低、中、高3个剂量组对裸鼠MHCC97H肝癌细胞自发性肺转移的转移抑制率分别是25.71%、32.80%、35.66%(P<0.05)。以上结果表明:sv-cystatin重组蛋白具有抑制肿瘤细胞体内外侵袭转移作用。此外,实验中还发现sv-cystatin重组蛋白对肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用。3蛇毒cystatin重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡通过FCM、TUNEL法及超微结构的观察等方法,探讨sv-cystatin重组蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响;通过比色法测定Caspase-2和Caspase-3的活性、Griess reagent法测定肿瘤细胞NO分泌量、实时定量PCR及Western Blot法测定Cyto C、Bcl-2、Bax和Bcl-w的表达,结果表明:sv-cystatin重组蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡;上调Caspase-2和Caspase-3的活性、刺激NO分泌、增加Cyto C的表达、调节Bcl-2、Bax、Bcl-w的表达,提示sv-cystatin重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与线粒体凋亡途径中Cyto C、Caspase-2和Caspase-3等分子的参与、凋亡调控基因Bcl-2、Bcl-w及Bax的表达及NO的介导有关。4蛇毒cystatin重组蛋白抑制肿瘤血管生成通过观察不同浓度的sv-cystatin重组蛋白对HUVEC细胞生物学特性的影响、C57BL/6小鼠B16F10实验性肺转移及裸鼠MHCC97H肝癌细胞自发性肺转移实验中微血管密度(MVD)的变化情况,结果表明:sv-cystatin重组蛋白能够抑制HUVEC—肿瘤细胞的粘附能力及HUVEC体外新生小管的形成;能够显著降低C57BL/6小鼠肺转移组织及裸鼠原位肿瘤组织的MVD。通过sv-cystatin重组蛋白分别处理MHCC97H及HUVEC细胞,检测MHCC97H细胞的VEGF-A及bFGF,HUVEC细胞Flt-1、FGFR-1的mRNA和蛋白水平表达,结果表明:sv-cystatin重组蛋白能够抑制bFGF、VEGF-A及其受体Flt-1的表达。这些资料表明sv-cystatin重组蛋白能够抑制肿瘤血管生成;VEGF/Flt-1/RTK系统可能是其抑制肿瘤血管生成的重要机制之一。综上所述,本研究运用基因工程方法生产并纯化sv-cystatin重组蛋白,证明其具有体内外抗肿瘤侵袭转移作用、诱导肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤血管生成作用,为其作为抗肿瘤侵袭转移药物的开发和应用提供理论依据。