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本论文包括二部分: 第一部分：鱼油对新生大鼠坏死性小肠结肠炎肠损伤的保护作用 目的: 本实验旨在通过配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合构建新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型,并预防性口服鱼油干预,观察新生大鼠一般状况、肠道病理改变、NEC发病率等指标来探讨预防性服用鱼油是否对新生大鼠NEC模型肠道有保护作用,为进一步深入机制研究提供实验基础。 材料与方法: 母乳喂养1日龄清洁级Sprague-Dawley(SD)新生大鼠36只,雌雄不限,随机分为三组,对照组(CON组,n=12),NEC组(NEC组,n=12),鱼油干预组(FO组, n=12)。FO组大鼠乳鼠喂养1周,自生后第一天起每日予鱼油(浓度为35％,剂量为0.6ml/100g.d)灌胃一次,持续7日后予配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合方法构建NEC模型;NEC组乳鼠喂养1周,自生后第一天起每日予等量生理盐水灌胃1次,持续7日后予配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合方法构建NEC模型;CON组乳鼠喂养实验始终,自生后第一天起每日插胃管一次,持续7天。自第8日起NEC组和FO组予配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合方法构建NEC模型,持续3日,观察三组大鼠造模72小时一般状况、腹胀、粪便等情况及死亡率,并于造模72小时断颈法处死所有大鼠,留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织,观察肠道大体形态改变和HE染色病理组织学检查结合肠道组织损伤病理评分比较三组NEC发病率。 结果: 1、三组新生大鼠外观表现及一般情况:CON组大鼠活动度良好,无腹胀,大便次数及性状正常,体重增长良好,皮下脂肪丰满。NEC组大鼠自造模24小时起相继出现腹胀、不同程度地解黄绿色粘液稀便,大便次数增多,活动度下降、反应迟钝、外观消瘦,呼吸增快,随着造模时间延长上述表现逐渐加重。FO组大鼠表现介于两者之间,活动度尚可,大便次数稍增多,性状尚可,体重增长缓慢。 2、三组大鼠肠道大体形态、病理改变及肠道组织损伤病理评分比较:CON组大鼠回肠呈淡黄色,弹性佳,无充血、积气等改变,镜下见肠道绒毛完整,结构正常。NEC组大鼠肠道发黑,肠腔不同程度扩张、积气,肠壁变薄,镜下观察见重度黏膜下和固有层分离,不同程度绒毛脱落、坏死、肠腺缺失,大量炎性细胞浸润等病理改变。FO组大鼠肠道稍扩张,程度较 NEC组轻,镜下见轻至中度黏膜下、固有层分离,黏膜下水肿,炎性细胞浸润,局部绒毛脱落。CON组、NEC组、FO组三组大鼠肠道组织损伤病理评分分别为0.16±0.17,2.39±0.51,1.77±0.59,三组间比较有统计学差异(P<0.05),NEC组肠道组织损伤病理评分比CON组和FO组明显升高,差异均有统计学意义(均 P<0.05),FO组肠道组织损伤病理评分显著高于CON组(P<0.05)。 3.三组新生大鼠 NEC发病率及死亡率比较:CON组大鼠无一例发生 NEC, NEC组12只新生大鼠中有10只发生NEC,NEC发病率为83.33％,FO组12只新生大鼠中有4只发生 NEC,NEC发病率为33.33％,其发病率在三组间比较有统计学差异(P<0.05);与CON组和FO组相比,NEC组其发病率明显升高,差异均有统计学意义(均 P<0.05);与 CON组相比, FO组 NEC发病率亦显著升高(P<0.05)。NEC组大鼠中有一例死亡,CON组、FO组无大鼠死亡,三组间死亡率比较无明显统计学差异(P>0.05)。 结论: 1、配方奶喂养+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素联合可成功构建NEC模型。 2、预防性口服鱼油可降低新生大鼠NEC的发病率,减轻肠道损伤。 第二部分：内质网应激偶联炎症反应在新生大鼠坏死性小肠结肠炎中的作用及鱼油保护机制的研究 目的: 通过鱼油预防干预、并构建新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型,动态研究新生大鼠NEC发病过程中肠组织内质网应激(ERS)相关指标GRP78、Caspase-12和促炎症性因子TNF-α、IL-6的表达变化及其与肠道组织损伤的关系,进一步深入探讨ERS及炎症反应在NEC发病机制中的作用,并试图揭示预防应用鱼油对新生大鼠NEC肠道保护作用的可能作用机制,为临床预防和治疗NEC提供新思路和实验依据。 材料与方法: 母乳喂养1日龄清洁级Sprague-Dawley(SD)新生大鼠96只,雌雄不限,随机分为3组,对照组(CON组,n=32)、NEC组(NEC组,n=32)和鱼油干预组(FO组, n=32)。 FO组大鼠乳鼠喂养1周,自生后第一天起每日予鱼油(浓度为35％,剂量为0.6ml/100g.d)灌胃一次,持续7日后予配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合方法构建NEC模型。NEC组大鼠乳鼠喂养1周,自生后第一天起每日予等量生理盐水灌胃,持续7日后予配方奶喂养+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素联合方法构建NEC模型。CON组大鼠乳鼠喂养实验始终,自生后第一天起每日予插胃管1次,持续7天。观察三组大鼠造模0小时、24小时、48小时、72小时各个时间点一般状况、腹胀、粪便等情况及死亡率;并分别于造模过程中各个时间点随机取8只处死,留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织,观察肠道大体形态改变,HE染色病理组织学检查结合肠道组织损伤病理评分比较三组上述时间点肠道损伤程度;取部分肠道组织采用免疫组织化学技术检测GRP78和Caspase-12蛋白表达;采用Western-blot技术检测Caspase-12蛋白的表达;酶联免疫法(Elisa)检测肠道组织中促炎性因子——IL-6和TNF-α表达。 结果: 1、三组新生大鼠外观表现及体重增长情况:实验过程中,CON组大鼠活动度良好,无腹胀,大便次数及性状正常,体重增长良好,皮下脂肪丰满。自造模刺激开始后 NEC组大鼠相继出现腹胀、不同程度地解黄绿色粘液稀便,大便次数增多,活动度下降、反应迟钝、外观消瘦,呼吸增快,随造模时间延长上述表现逐渐加重。FO组大鼠表现介于两者之间,活动度尚可,大便次数稍增多,性状尚可。 2、三组新生大鼠肠道大体形态及肠道组织病理评分比较:CON组大鼠回肠呈淡黄色,弹性可。NEC组大鼠24小时肠道大体形态外观基本正常,48小时外观色泽较深,肠腔有不同程度扩张、肠管弹性差,72小时肠道发黑,肠腔扩张,肠壁变薄。FO组大鼠24、48小时肠道大体形态外观基本正常,72小时肠道稍扩张,少数有积气。随着造模时间延长,NEC组和 FO组肠道组织损伤病理评分逐渐增加, NEC组在24、48、72小时三个时间点肠道组织损伤病理评分均高于 CON组和 FO组,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。FO组在24、48、72小时三个时间点肠道组织损伤病理评分均高于CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。 3、三组新生大鼠肠道组织中ERS相关分子——Caspase-12蛋白的动态表达:随着造模时间延长,NEC组和 FO组肠道组织中 Caspase-12蛋白表达呈递增趋势,从24小时开始升高,于72小时达高峰。NEC组在24、48、72小时三个时间点肠道组织中 Caspase-12蛋白的表达均高于 CON组和 FO组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。FO组在24、48、72小时三个时间点肠道组织中 Caspase-12蛋白的表达均高于CON组,差异均有统计学意义(P<0.05)。 4、三组新生大鼠肠道组织中 ERS相关分子——GRP78蛋白的动态表达:随着造模时间延长,NEC组和 FO组两组肠道 GRP78的表达呈递增趋势,从24小时开始升高,48小时达高峰,72小时仍持续高表达。 NEC组在24、48、72小时三个时间点肠道组织 GRP78的表达均高于 CON组和 FO组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。FO组在24、48、72小时三个时间点肠道组织GRP78的表达均高于CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。 5、三组新生大鼠肠道 TNF-α、IL-6的动态表达:随着造模时间延长, NEC组和 FO组两组肠道 TNF-α、IL-6的表达逐渐升高,并于72小时达高峰。NEC组在48、72小时两个时间点肠道组织TNF-α、IL-6的表达均高于CON组和FO组,差异有统计学意义(P<0.05)。FO组在48、72小时两个时间点肠道组织 TNF-α、IL-6的表达均高于CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。 6、肠道组织中 TNF-α、IL-6、Capase-12的表达水平和肠道损伤病理评分的相关性分析:肠道组织 IL-6的表达水平和肠道组织损伤病理评分呈正相关关系,直线等级相关系数为0.914(P<0.01);肠道组织TNF-α的表达水平和肠道组织损伤病理评分呈正相关关系,直线等级相关系数为0.894(P<0.01),肠道组织Caspase-12的表达水平和肠道组织损伤病理评分呈正相关关系,直线等级相关系数为0.926(P<0.01)。 结论: 1.肠道组织ERS相关指标——GRP78、Caspase-12和促炎症性因子TNF-α、IL-6在NEC模型组中均表达升高,且随造模刺激时间延长呈进行性升高,并与肠道损伤程度呈正相关,提示ERS和炎症反应可能参与NEC的发生、发展。 2.预防性服用鱼油能降低 NEC大鼠肠道组织中 ERS标志 GRP78、Caspase-12和促炎症性因子TNF-α、IL-6的表达,减轻NEC大鼠肠道损伤的程度,提示其保护作用可能是通过抑制ERS和炎症反应而起作用。