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第一部分巨噬细胞在哈族食管鳞癌组织的分布特征及其临床病理学意义目的:探讨不同亚型的巨噬细胞和表型分子与侵袭转移相关蛋白在哈族食管鳞癌组织中的表达、分布特征及其与临床病理特征、预后的相关性。方法:(1)收集哈族食管鳞癌和癌旁正常组织280例,制备白片和组织芯片;(2)应用免疫组化法进行CD68,HLA-DR双染和CD163染色,分别检测M1和M2型巨噬细胞在哈族食管鳞癌组织中的分布,并分析其与食管鳞癌患者临床病理及预后的关系。(3)以CD34和D2-40为标记检测微血管和淋巴管在食管鳞癌组织中的分布;应用免疫组化法检测HLA-DR、浸润转移相关基因VEGF和MMP9的表达情况及其临床病理学意义;(4)综合分析哈族食管鳞癌组织中巨噬细胞的密度与HLA-DR、VEGF和MMP-9的表达及微血管和淋巴管的密度之间的相关性;结果:(1)M1和M2型巨噬细胞分布于食管鳞癌的癌巢和癌周间质中,癌周间质中巨噬细胞密度明显高于癌巢;哈族食管鳞癌组织癌巢和间质中M1、M2型巨噬细胞的密度明显高于癌旁正常组织(癌巢中M1型密度:3.28±2.23 vs 1.04±0.86,间质M1型密度:11.67±5.8vs6.41±2.05;癌巢中 M2 型密度:13.18±11.24 vs 1.73±1.73,间质M2型密度:55.21±25.71 vs20.90±9.60;P均<0.001),哈族食管鳞癌组织中M2/M1巨噬细胞的比值同样明显高于癌旁正常组织(癌巢:4.96±4.47vs 1.57±1.67;间质:6.44±5.81 vs 3.53±1.75;P均<0.001);(2)结合临床病理参数,我们发现间质中M1型巨噬细胞密度与食管鳞癌患者淋巴结转移呈明显的负相关(P<0.05),而癌巢和间质中M2型巨噬细胞密度和M2/M1比值与哈族食管鳞癌患者脉管浸润、淋巴结转移和临床分期呈明显正相关(P均<0.05),同时发现M2/M1巨噬细胞比值在食管鳞癌间质中还与肿瘤的浸润深度呈明显的正相关(P<0.05);间质中高密度的M2型巨噬细胞和高M2/M1比值预示食管鳞癌患者较差的预后(P<0.05);Cox多因素回归分析发现M2型巨噬细胞的密度与患者不良预后密切相关(P<0.05),可以作为哈族食管鳞癌患者的独立预后因素。(3)巨噬细胞是HLA-DR重要的表达组成细胞之一,食管鳞癌组织中HLA-DR表达明显高于癌旁正常组织,但与哈族食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈明显的负相关(P<0.05);哈族食管鳞癌组织VEGF和MMP9的表达及微血管和淋巴管的分布数量明显高于癌旁正常组织,且与哈族食管鳞癌患者淋巴结转移和临床分期呈正相关(P均<0.05);(4)结合M2巨噬细胞的在食管鳞癌的分布特点,分析发现间质中的M2型巨噬细胞及M2/M1的比值与HLA-DR的表达呈明显负相关,与微血管、淋巴管的分布、VEGF和MMP9的表达呈明显正相关(P均<0.05);结论:(1)M2型巨噬细胞的增加与哈萨克族食管癌组织中微血管、淋巴管的密度以及患者脉管浸润、淋巴结转移和临床分期呈明显正相关,高密度的M2型巨噬细胞可能是哈族食管鳞癌高侵袭性和不良预后的重要参考指标;(2)M2型巨噬细胞密度的增高与表型分子HLA-DR表达的降低及侵袭转移相关蛋白VEGF和MMP9的过表达呈正相关,提示这些分子可能参与哈族食管癌的浸润和转移过程。第二部分HLA-DR介导巨噬细胞对食管癌生物学行为的影响及机制初探目的:探讨HLA-DR介导巨噬细胞表型的转化对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及其初步作用机制。方法:(1)利用Transwell小室将巨噬细胞与食管鳞癌细胞非接触性共培养,通过免疫荧光、实时定量qRT-PCR法检测共培养前后巨噬细胞的表型(CD163,HLA-DR/CD68,HLA-DR,TNF-a,IL-10)的改变,应用倒置显微镜观察共培养前后肿瘤细胞形态的变化:(2)采用qRT-PCR和westernblot检测共培养后巨噬细胞中侵袭转移相关基因VEGF和MMP9表达的变化;应用CCK8、集落克隆形成实验、Transwell迁移及侵袭实验分别检测巨噬细胞对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;(3)慢病毒shRNA转染下调巨噬细胞中HLA-DR的表达,应用免疫荧光、qRT-PCR和westernblot检测转染后巨噬细胞表型的改变;qRT-PCR和westernblot检测下调HLA-DR的巨噬细胞所产生侵袭转移相关基因VEGF和MMP9表达的变化;应用CCK8增殖、Transwell迁移及侵袭实验分别检测下调HLA-DR的巨噬细胞对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)食管鳞癌细胞与巨噬细胞共培养48h后,免疫荧光显示CD163阳性巨噬细胞(M2型)数目明显增多,CD68/HLA-DR双染(M1型)巨噬细胞数目明显减少;qRT-PCR检测同样显示巨噬细胞M2表型标记IL-10表达明显增高,而M1表型标记HLA-DR和TNF-a表达明显降低(P<0.05);westernblot检测从蛋白水平也证实了共培养后M2表型巨噬细胞的增多;(2)共培养后多数食管鳞癌细胞由圆形上皮特性变为梭形间叶细胞特性,同时发现共培养后巨噬细胞中MMP9和VEGF mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05);CCK8增殖和集落克隆形成实验显示食管鳞癌细胞增殖活性与对照组相比明显降低(P<0.05);Transwell迁移和侵袭实验显示共培养后食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力均明显增加(P均<0.05);(3)干扰下调巨噬细胞中HLA-DR的表达后,巨噬细胞中HLA-DR、TNF-a的表达明显下调,IL-10表达明显升高(P均<0.05),显示更多巨噬细胞向M2表型巨噬细胞的转化;(4)共培养体系中下调HLA-DR的巨噬细胞所产生的MMP9和VEGF明显增多(P均<0.05);下调HLA-DR的巨噬细胞与食管鳞癌细胞共培养后,食管鳞癌细胞增殖能力明显提高,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显增加(P均<0.05)。结论:(1)巨噬细胞与食管癌细胞共培养促进了 M2型巨噬细胞表型转化和食管癌细胞的侵袭与转移,HLA-DR具有促进M2型巨噬细胞转化的作用;(2)干扰HLA-DR可以影响VEGF和MMP9的表达和食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与HLA-DR下调促进M2表型巨噬细胞转化进而增加VEGF和MMP9的分泌等有关,但具体分子机制尚需进一步的体内外实验研究。