原发性肝癌是常见的消化系统肿瘤之一,其发病率和死亡率呈现逐渐上升的趋势,全世界每年约有800000例患者罹患HCC,且预后较差,是死亡率第三高的癌症。目前肝癌的治疗手段包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗等,其中肝癌的药物治疗仍是主要治疗手段之一。目前临床上使用的传统抗肝癌药物最大的缺点是缺乏组织选择性,在体内分布广泛,使其在发挥药效的同时往往产生严重的全身性毒副作用。因此,开发和研究高效低毒的新型抗癌药物已成为肝癌化疗药物研发的重点。我们前期研究发现结构全新的吲哚酰肼类化合物IHZ-1能够通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路以及激活ROS/JNK途径阻断肝癌细胞的周期进程并诱导细胞凋亡。活性氧（ROS）广泛参与细胞的各项生命活动,并在凋亡和自噬的过程中扮演重要角色。研究显示部分诱导癌细胞凋亡的化合物也能诱导癌细胞发生自噬。自噬的双效性体现在低水平的自噬可以作为细胞清除自身受损细胞器的自我保护机制,而超过阈值的高水平自噬能够诱发自噬性细胞死亡。因此,研究IHZ-1上调的ROS能否激活自噬以及自噬发生后对肝癌细胞凋亡的影响,一方面能够进一步阐明IHZ-1的抗肝癌作用机制,另一方面也为部分化疗药物激活自噬后疗效降低的问题提供解决策略。为了研究IHZ-1激活ROS是否诱导了自噬的发生,我们选取Hep G2和Huh7两株肝癌细胞展开深入研究。首先采用吖啶橙染色检测IHZ-1处理后肝癌细胞中酸性细胞器的数量,结果显示5μM和10μM IHZ-1处理后Hep G2细胞中酸性细胞器数量显著提高,但Huh7细胞中的酸性细胞器数量并没有明显的变化。由于酸性细胞器数量对于自噬发生只是一个间接检测指标,为了进一步研究IHZ-1是否诱导肝癌细胞发生自噬,我们采用Real Time-PCR技术检测自噬相关基因的转录水平,结果显示Beclin1、Atg5和ULK1的转录水平在IHZ-1处理后均有不同程度的提高。进一步的研究发现IHZ-1能够诱导转染了GFP-LC3-II质粒的肝癌细胞出现大量的GFP-LC3-II点状聚集,Western Blot的结果也进一步验证了IHZ-1的确上调了LC3-I向LC3-II的转化水平,然而自噬底物P62的表达并未降低,提示IHZ-1激活的自噬流可能并不完整。为了进一步验证IHZ-1是否诱导了完整的自噬流。采用自噬抑制剂氯喹（CQ）与IHZ-1联合处理肝癌细胞,结果显示与氯喹单独处理组相比,联合处理组P62水平下调,以上结果表明IHZ-1在两种肝癌细胞中均激活了自噬且自噬流是完整的。为了进一步研究IHZ-1所诱导的自噬对凋亡的影响,我们采用CQ和IHZ-1联合处理肝癌细胞检测其凋亡水平,结果显示与IHZ-1处理组相比,CQ和IHZ-1共处理组凋亡水平显著提高,说明抑制自噬能够提高IHZ-1对肝癌细胞的促凋亡作用。综上所述,IHZ-1能够增加ROS的累积进而激活肝癌细胞发生自噬,而抑制自噬能够增强IHZ-1对肝癌细胞的促凋亡作用,提示IHZ-1刺激活化的细胞自噬可能是肝癌细胞的自我保护机制。我国已经开始步入老龄化社会,逐渐增加的老年人口及快速老龄化进程导致一系列与年龄有关疾病患病率的增加,比如癌症。近年来研究显示,引起个体衰老的众多因素中,衰老细胞的累积是驱动衰老和衰老相关疾病发生、发展的重要因素。衰老细胞的累积及无法及时清除将造成组织微环境的破坏或将诱发衰老相关疾病,因此清除衰老细胞或许是治疗或缓解与年龄相关疾病的有效手段。在2011年首次报道了在小鼠体内清除衰老细胞可以延长寿命以及延缓衰老相关疾病。同时,进一步的研究发现将衰老细胞注射到年轻小鼠体内能够让正常小鼠的寿命缩短最多35%,而靶向清除这些衰老细胞不但能够延长小鼠寿命,同时可以延缓肿瘤的发生发展,维持组织和器官的功能。然而转基因模型和药物的局限性使清除衰老细胞的策略在生理条件下的应用受到限制。因此,开发靶向清除衰老细胞的抗衰老药物成为该领域的研究热点,其中基于衰老细胞具有高表达抗凋亡家族蛋白的特性,靶向衰老细胞的抗凋亡及促生存通路而开发出了选择性清除衰老细胞的化合物,被称作“senolytics”。意为:裂解衰老细胞的化合物。本课题前期发现中药黄芪中的单体成分环黄芪醇（cycloastragenol,CAG）具有选择性清除衰老细胞和抑制衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）的作用,其机制可能通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2而诱导衰老细胞凋亡,同时通过下调磷酸化的P38MAPK/NF-κB、JAK/STAT3蛋白抑制IL-6等SASP的表达,提示CAG可能具有“senolytic”的抗衰老活性。为了进一步研究CAG在体内的“senolytic”活性及抗衰老作用,采用颈背部皮下注射D-gal建立衰老小鼠模型,连续注射8周并在第6周同时灌胃给予低浓度（20mg/kg）和高浓度（40mg/kg）的CAG,记录小鼠的体重和器官重量变化,初步评价CAG口服给药的安全性。结果显示长期给予CAG对小鼠体重和器官系数并无明显影响,在一定程度上说明CAG对小鼠无显著的毒性作用。同时,Micro-CT的结果显示CAG能够改善D-gal诱导的衰老小鼠骨皮质的流失。Real Time-PCR结果显示CAG能够下调衰老小鼠脂肪组织中p16INK4A的转录水平,提示CAG可能对衰老小鼠脂肪组织中的衰老细胞具有清除作用。接着,通过ELISA和Real Time-PCR检测小鼠血清和组织中SASP的水平,结果显示CAG能够下调小鼠血清中IL-6的表达水平同时抑制肝脏和脂肪组织中CXCL-10的转录水平,提示CAG对衰老小鼠SASP的表达具有抑制作用。组织的WB结果显示CAG能通过抑制肝脏和脂肪组织中STAT3的磷酸化水平,初步提示CAG可能通过抑制STAT3进而下调SASP的表达。以上结果初步表明CAG在衰老小鼠体内同样具有清除衰老细胞和抑制SASP的作用,这与细胞水平的研究结果是相似的。综上所述,CAG能够改善D-gal诱导的衰老小鼠的部分衰老表型,其机制可能与P16的下调和SASP的抑制有关。