论文部分内容阅读
肝癌是世界上恶性程度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位。尽管目前肝癌的治疗方法有很多种，但疗效都十分有限，并未显著延长病人的生存期。细胞凋亡机制的异常在肿瘤发生和抗肿瘤治疗中发挥重要作用，现有的研究提示很多抗肿瘤治疗通过诱导肿瘤细胞的凋亡起作用。诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤治疗的热点，并有可能成为肿瘤治疗的新途径。TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，是新近发现的介导细胞凋亡的信号分子，具有TNF家族成员的许多特性。TRAIL可以在许多组织中表达，通过与其特异性受体的相互作用来发挥促凋亡作用。到目前为止，TRAIL一直被大多数人认为只诱导肿瘤源性细胞和转化细胞而不诱导下常细胞的凋亡。TRAIL具有旁观者效应，即它不仅能诱导转导TRAIL基因的肿瘤细胞的凋亡，而且能使转导细胞附近的、未被转导TRAIL基因的肿瘤细胞发生凋亡。TRAIL基因对肝癌细胞的促凋亡作用、旁观者效应，以及旁观者效应是否能被可溶性因子，如可溶性TRAIL分子或各种细胞因子介导，国内外对此研究不多。本实验 浙江大学医学院2002届硕士学位论文 使用双腺病毒载体系统Ad／GT－TRAIL＋AMIGK－GV16对TRAIL基因抗 人肝癌细胞SMMC7721的活性和旁观者效应，及其对正常细胞BMFB 的生长抑制作用进行了研究。 实验材料和方法 实验材料 细胞系：人胚肾细胞株293 细胞，人肝癌细胞株 SMMC772 和正常人骨髓成纤维细胞（BMFB）；腺病毒载体： Ad／GT－TMIL，Ad／GT－Bax，AdJGT－LacZ，Ad／PGK－GV16；其它如细胞 培养材料，RT－PCR材料，各种实验试剂、耗材和仪器等。 实验方法和步骤1）病毒扩增、纯化、鉴定和滴度测定：人肚 肾细胞株293 细胞扩增各重组腺病毒Ad／GT＊RAIL，Ad／GT－Bax， Ad／GT－LacZ，Ad／PGK－GV，用 CsCI超速梯度离心法纯化，分光光度 仪在 260urn处测 OD值换算得病毒滴度，检测 EI＋腺病毒和内毒素感染； 2）RT．PCR检测 TMIL基因表达：IX 106个 SMMC7721 细胞感染 Ad／GT－TM！L＋Ad／PGK－GV和 Ad／GT－LacZ＋Ad／PGK－GV，培养 2 天后，TRIZOL法提取细胞总RNA，经RT．PCR逆转录为CDNA，再 以5’－AGA CCT GCG TGC TGA TCG TG－3’作为卜游引物，以5，＊TA TTT TGC GGC CCA GAG CC。3’作为下游引物，条件（95℃45秒，58 ”C 45秒，72”C 45秒），35循环进行PCR扩增，PCR产物以 1O凝胶 电泳检测条带；3）细胞生长曲线：将 SX 103个 SMMC7721细胞和 BMFB细胞分别接种于96孔板每孔，设立3个平行孔，接种后第二天， 以 MOI 500 分别感染 Ad／GT－TRAIL＋Ad／PGK．GV16，Ad／GT．Bax＋ Ad／PGK－GV（阳性对照），Ad／GT－LacZ＋Ad／PGK－GV（载体对照）， 和 PBS（空白对照），在感染后的第 0，l，3，5天，MTT法绘制细胞 生长曲线；4）凋亡检测：6孔板每孔接种 SMMC7721 细胞 SX 10‘ 2 浙江大学医学院2002届硕土学位论文 个，接种第二天以 MOI 500分别感染各组病毒，每天用倒置显微镜观察 细胞形态变化；感染5天后，用ANNEXIN VII凋亡试剂盒在流式细 胞仪上检测细胞凋亡率；5）旁观者效应实验：将 SMMC7721 ／’I’RAIL 细胞和 SMMC7721细胞消化制成 5 XIO‘加l细胞悬液，按不同比例混合 接种96孔板培养，每一比例设3个平行孔，每孔接种混合细胞200 yi 门 101昆合细胞人接种后培养 4天，MTT法检测细胞存活率；6）旁 观者效应机理研究：以转导细胞的培养液滤去细胞成分作为培养液培养 SMMC7721 细胞，以RPMI 1640 培养基作为空白对照，感染 AdiGT．TRAIL＋Ad／PGK－GV作为阳性对照，4天后 MTT法检测细胞 存活率：刀实验数据用驼S引0刀进行统计，所得结果均进行配对T检 验。 结果与讨论 1．病毒扩增、纯化、鉴定后，用光密度值法测得各种病毒滴度为1 X1010partlcles／ml。 2 ＊＊＊IL 基因表达纪果：RT－P＊R 产物J疑胶电泳显示， Ad／GI”一”fRAIL十 Ad／PGK一GV16 感染可在413hp 处看乡特异性条带，表 明TRAIL基回转入细胞。TRAIL基因是TNF超家族成员，能快速诱导 转导细胞的凋亡，构建带有组分启动子的TRAIL基因的腺病毒载体相 当困难，因