季节性气候因素对养殖业的影响不容忽视,作为一个养殖业大国,我国每年由热应激造成的养殖业经济损失十分惊人。因此,增加针对动物的热应激损伤特征和规律研究对减少热应激损伤具有重要意义。热应激是一种全身性的反应,对动物的行为、采食量、生产性能、血液循环、神经内分泌、免疫和生殖等方面均会产生不利影响。但热应激过程中可转录合成一组具有高度保守性的特殊蛋白-热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)对维持细胞生存和内环境的稳定也起着十分重要的作用。热休克蛋白60(Hsp60)作为热休克蛋白家族重要的一员,已被证明与心血管疾病、自身免疫系统疾病等的发生发展密切相关。本文的主要目的在于通过对大鼠和离体培养的鼠源H9C2心肌细胞进行不同时间的热应激处理,拟动态观察和了解热应激大鼠心肌细胞中Hsp60及其相应mRNA的转录和表达水平,以及Hsp60在体内、外心肌细胞中的定位和分布等特点,研究热应激过程中Hsp60的变化规律与大鼠心肌细胞热应激损伤的相关性,探讨Hsp60的组织细胞保护机制。为研究热应激对体内、外大鼠心肌细胞造成的应激性损伤及其程度,本试验通过病理学检测,观察了受试大鼠心肌细胞和鼠源H9C2心肌细胞在遭受不同时间的热应激处理后所呈现的应激性损伤变化。试验结果显示,热应激处理初期,受试大鼠的呼吸频率加快,被毛粗乱,烦躁不安,随后大量出汗,俯卧少动。待热应激处理至60 min时出现大鼠的热应激猝死,热应激处理100 min后,50%的受试大鼠猝死,热应激处理2 h内,100%的受试大鼠发生猝死;离体培养的H9C2心肌细胞在遭受热应激的时间达60 min时,细胞的活力和存活率开始显著下降,热应激处理240 min后,约50%的H9C2大鼠心肌细胞死亡。说明离体培养的H9C2大鼠心肌细胞对热应激的耐受时间更长;组织病理学结果显示,热应激处理20 min后大鼠心肌细胞肿胀,心肌细胞质浑浊,呈现明显的颗粒变性。热应激处理40 min组大鼠的部分心肌细胞发生明显的颗粒变性,细胞质嗜酸性显著增强。热应激处理至100 min组大鼠的心肌细胞断裂较为明显,心肌细胞核浓缩;细胞病理学结果显示,20 min热应激处理组H9C2大鼠心肌细胞的体积肿大,形态变圆,细胞浆内出现少量的红染颗粒。40 min热应激处理组心肌细胞的胞浆内出现较多的红染颗粒。60 min热应激处理组H9C2大鼠心肌细胞出现脱落现象,细胞形态变圆且细胞边缘出现不规则的突起,细胞体积显著变大,胞浆内出现大量密集分布的红染颗粒。热应激导致的大鼠心肌细胞和离体培养鼠源H9C2大鼠心肌细胞的病理学变化均随着热应激处理时间的延长而加剧,但离体培养心肌细胞表现出更强的热应激耐受性。为研究动物心肌细胞内Hsp60表达变化在热应激性心肌损伤以及动物猝死中的作用,本试验通过热应激过程中体内、外大鼠心肌细胞中Hsp60及其相应mRNA的表达水平和在细胞的定位等进行了动态观察,并对Hsp60表达改变与心肌的热应激损伤的相关性进行了比较分析。结果显示,体内、外大鼠心肌细胞中Hsp60蛋白及其mRNA表达量随着热应激时间的增加而显著升高,虽然Hsp60蛋白在体内、外的表达水平未出现在同一时间点的一致升高,但其表达变化出现的时间与各自细胞组织病理学损伤程度相一致。Hsp60的表达变化反映了体内、外心肌细胞损伤程度的变化;不管是在体动物的心肌细胞还是离体培养的H9C2大鼠心肌细胞,Hsp60蛋白都只存在于心肌细胞的细胞浆,细胞核中没有检测到Hsp60的分布。但随着热应激时间的延长,Hsp60在细胞内的分布逐渐向细胞膜方向扩散,说明热应激可能会导致大鼠心肌细胞内的Hsp60发生跨膜转移。Hsp60可以与多种因子相互作用,其中,Hsp10是公认的Hsp60发挥分子伴侣作用的辅助因子。为了进一步研究哺乳动物心肌细胞内Hsp60的表达与动物对环境应激的耐受机制,本试验对Hsp60相关蛋白Hsp10在热应激大鼠心肌细胞中的表达和定位进行了动态检测。结果显示,与热应激过程中离体培养H9C2心肌细胞内Hsp60蛋白的表达变化不同,心肌细胞内Hsp10表达水平在热应激过程中无显著变化。但在体和离体大鼠心肌细胞内hsp10mRNA转录水平则表现为先降低后升高的趋势,表现出与hsp60 mRNA相一致的变化。在热应激初期,离体培养大鼠H9C2心肌细胞内Hsp60和Hsp10转录水平的降低程度不如其在体大鼠心脏中的降低水平显著,这可能与它们对热应激的耐受度不同有关。不同于Hsp60,Hsp10在热应激后H9C2心肌细胞中的定位有较为明显的向细胞核方向聚集的趋势,推测Hsp60和Hsp10在热应激过程中既共同发挥作用,又有各自的功能。热应激处理后,H9C2大鼠心肌细胞内Hsp60的分布会逐渐向细胞膜的方向扩散,当热应激时间进一步增加时,免疫荧光能够检测到细胞膜上有Hsp60的密集分布。因此推断,Hsp60可能进入细胞外环境并发挥其生理功能。为了进一步验证该推断,本试验检测了 H9C2大鼠心肌细胞培养上清液中Hsp60的含量,证实在热应激H9C2细胞培养上清液中Hsp60的含量增加。通过在体外培养的H9C2大鼠心肌细胞的培养基中加入过量的山羊抗鼠Hsp60抗体,以中和热应激后心肌细胞外环境中的Hsp60蛋白,然后再检测热应激H9C2心肌细胞的凋亡情况。结果显示,在H9C2大鼠心肌细胞的培养基中加入Hsp60抗体后再对心肌细胞进行热应激处理,心肌细胞的凋亡率显著升高,说明细胞外Hsp60对热应激大鼠心肌细胞有保护作用。对其机理进行进一步研究表明,其机制与ERK、JNK的激活有关,与P38磷酸化关系不显著。而且ERK主要参与了 Hsp10对细胞作用的调节。抑制细胞外的Hsp60后,热应激后H9C2大鼠心肌细胞内编码Hsp60和Hsp10蛋白的基因表达量急剧增加,Hsp60相关蛋白Hsp10的表达也显著升高,但是Hsp60的含量则显著降低,这可能是由于细胞膜上的Hsp60与加入细胞培养基中的抗体结合后,无法再结合检测抗体,导致其水平显著下降。该研究结果也进一步说明,热应激过程中Hsp60和Hsp10既共同发挥作用,又发挥各自的功能。