CD105(ENDGLIN)在角膜新生血管形成中的作用的研究

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目的:建立大鼠角膜新生血管模型,研究CD105与VEGF表达以及角膜新生血管形成的相关性,并应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对CD105的siRNA,抑制CD105在体外培养的脐静脉内皮细胞中的表达,观察CD105沉默后对VEGF表达和细胞生长的影响。方法:明胶海棉蘸取碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)100 ng后,再用2%的琼脂糖包裹制成缓释药丸。将干燥后的小丸植入SD大鼠角膜基质层建立角膜新生血管模型,术后观察3周,照相,病理组织学检查。按照不同时间,对角膜新生血管的情况进行形态学分析,用免疫组织化学、计算机图像分析系统、RT-PCR法检测新生血管形成不同时间点CD105和VEGF在角膜中的表达。根据人的CD105 mRNA序列(genebank accession number:)选择3个不同的靶位点,分别合成3条CD105 siRNA,并同时合成阴性对照和阳性对照SiRNA。采用脂质体介导的基因法转染至体外培养的脐静脉内皮细胞中,采用RT-PCR检测各组细胞CD105和VEGF mRNA表达水平,Western blot检测技术法检测干扰前后CD105和VEGF蛋白表达水平,并用MTT法检测HUVEC的细胞活力。结果:4天即可见新生血管从角膜缘向角膜中心伸展,成束状,较稀疏,范围较局限;10d达最高峰,观察3周尚未消退完全。病理组织学检查HE染色可见新生血管生长过程中未见明显的白细胞浸润。体内实验中免疫组化和RT-PCR结果显示CD105和VEGF的表达情况与新生血管的生长呈平行关系,且二者的表达情况也呈平行关系。体外实验中,RT-PCR和Western blot的检测表明,3号CD105 siRNA能最有效沉默CD105的表达,转染后的HUVEC中CD105 mRNA水平和蛋白表达水平明显下降。在CD105表达下降的同时,VEGF mRNA水平和蛋白表达水平也呈平行下降。MTT结果表明CD105的下调导致了VEGF的下调从而使HUVEC的活力下降。结论:角膜囊袋法结合bFGF缓释药丸诱生的大鼠CNV模型经济,可重复,具有一致性,稳定可靠,易于在体观察和定量分析。CD105与角膜新生血管形成有相关性,在新生血管生长中扮演着重要角色。特异性的siRNA可以下调HUVEC中CD105 mRNA及蛋白表达水平,同时引起VEGF mRNA及蛋白表达水平下调,减低细胞活力。提示CD105可能对体外培养HUVEC的生长有促进作用,CD105可以作为治疗新生血管的靶向。
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