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第一部分Ishikawa细胞中子宫内膜相关生物标志物表达研究目的建立子宫内膜Ishikawa细胞模型,分别通过检测孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)、白血病抑制因子(LIF)、肝素结合生长因子(Hb-EGF)、环氧化酶2(COX-2)、胰岛素生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、血管内皮生长因子受体1(VEGF-R1)、白介素1β(IL-1β)八个子宫内膜容受性相关目的基因以及G6PDH、ALAS1、PGK-1、b-2M、b-actin、 HPRT、PBGD、RPⅡ八个能在不同细胞中稳定表达的内参基因在该细胞模型中的表达,以验证该细胞模型具备子宫内膜特异性与稳定性。通过检测在17β-雌二醇干预下孕激素受体(PR)、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、GO/GS期开关基因GOS2)的表达,以确定17β-雌二醇干预下Ishikawa细胞模型基因表达的稳定性。研究方法1.八个目的基因以及八个参考基因mRNA在Ishikawa细胞模型中的表达Ishikawa细胞常规培养72小时后,采用RT-qPCR检测细胞中预先选定的八个目的基因：PR、ER、Hb-EGF、LIF、COX-2、IGFBP-1、VEGF-R14、IL-1β及参考基因G6PDH、ALAS1、 PGK-1、b-2M、b-actin、HPRT、PBGD、RPI(各8个)mRNA的表达并采用Cq值表示其相对表达量。2.17β-estradiol干预下PR、ALPPL2、GOS2mRNA在Ishikawa细胞中的表达在接种密度50000cells/ml情况下,Ishikawa细胞无激素常规培养72小时,致细胞亚融合状态后添加不同浓度17β-estradiol干预48小时。采用RT-qPCR检测细胞中PR、ALPPL2、GOS2mRNA的表达,及PRmRNA相对于三种不同参考基因(ALAS1, G6PDH和β2M)的表达。EC50表示化学物产生50%最大效应的浓度。“S函数”量效曲线根据实时定量PCR结果制定,横坐标为17β-estradiol浓度,纵坐标为目的基因扩增Cq值的归一化比值(Normalized Ratio)。实验结果1.八个目的基因和八个参考基因均在Ishikawa细胞内稳定表达。2.17β-estradiol干预下PR、ALPPL2、GOS2mRNA呈现浓度依赖性上调性表达,ALPPL2和GOS2的mRNA表达水平高于PR,但PRmRNA上调性表达的增长倍数高于ALPPL2和GOS2。PRmRNA相对于三组不同管家基因：PRmRNA表达均上升,组间无差异(P>0.05)。实验结论本实验证明PR、ER、LIF等八个目的基因以及G6PDH、ALAS1、b-2M等八个内参基因在该Ishikawa细胞模型中的稳定表达,从mRNA水平上验证了Ishikawa细胞模型在一定程度上具备子宫内膜容受性生物特征和基因表达的稳定性。本实验同时证实了17p-雌二醇干预下下Ishikawa细胞PRmRNA上调性表达的稳定性。第二部分雌激素及雌激素样化学物对Ishikawa细胞PR表达的影响研究目的本实验利用Ishikawa细胞模型,以雌激素物质17β雌二醇(17β-estradiol).乙烯雌酚(DES)以及抗孕激素米非司酮(RU486)干预作为参考,检测“Feasibility study"项目中十一种有毒化学物：乙酰乙酸甲酯(MAA)、草氨酸(GLU)、甲氧基乙酸(methoxyacetic acid)、氯化钠(sodium chloride)、氯化铬(Cadmium choride)、多菌灵(Carbendazim)、硝基苯(Nitrobenzene)、除草醚(Nitrofen)、烯菌酮(Vinclozolin)、双酚A(BPA)、4-壬基酚(4-NP)对PR表达的影响,以确认是否具有雌激素样作用并区分其作用的强弱。研究方法1.雌激素、雌激素样化学物对Ishikawa细胞中PR蛋白及mRNA表达的影响Ishikawa细胞培养致细胞亚融合状态后按照梯度浓度添加17p-estradi6、DES以及11种待测化学物各干预48小时。采用RT-qPCR检测各干预组PRmRNA的表达。EC50值描述及“S函数”量效曲线建立同前。采用WesternBlotting检测各干预组PR蛋白的分泌。2. AlamarBlue分析培养板中处于亚融合状态下Ishikawa细胞,分为实验组(17p-estradiol、4-NP、DES和BPA不同梯度浓度分别十预48小时),另设对照组(培养液添加0.1%ETOH),各组均设复孔。采用AlamarBlue法检测各组不同浓度下的细胞活性。实验结果1.17p-estradiol、DES及"Feasibility Study"中BPA.4-NP干预下PRmRNA呈现上调性表达,并且通过qPCR吉果“S函数”量效曲线能够建立。RU486与其它的“Feasibility Study"化学物质干预下没有出现PRmRNA的上调性表达。17p-estradiol(EC50=2.44×10-11M)、DES(EC50=2.61×10-11M)的作用强于BPA(EC50=2.98×10-7M) WesternBlotting吉果显示17β-estradiol,4-NP, DES, BPA干预下PR蛋白表达增加,与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2. AlamarBlue结果显示PRmRNA上调性表达时没有产生显著的细胞毒性,细胞存活率差异没有统计学意义(P>0.05)。实验结论1.本实验Ishikawa细胞模型被证实不仅能够检测出化合物是否具备雌激素样作用,还能区分不同化学物激素样作用的强、弱。2."Feasibility Study"中的双酚A、4-壬基酚具备雌激素样作用,乙酰乙酸甲酯(MAA)本实验检测为雌激素阴性作用化学物。第三部分(抗)孕激素及(抗)孕激素样化学物对Ishikawa细胞PR及SULT1E1表达的影响研究目的本实验通过文献检索搜集出一些能和PR相互作用的化学物质和自然物质,并通过基因芯片技术确定抗孕激素RU486干预下Ishikawa细胞最敏感变化基因。采用Ishikawa细胞模型检测上述化学物质干预下对PR及最敏感基因表达的影响,确认其是否具有(抗)孕激素样作用并区分作用的强弱。研究方法1.检测Ishikawa细胞模型中在P4、P4+RU486影响下的敏感变化基因Ishikawa细胞培养致细胞亚融合状态后,用17p-estradiol(10-8M)继续诱导72小时,随后分别采用P4(10-8M)单独干预、P4+RU486(each,10-8M)混合干预培养细胞各48小时。使用Affymetrix基因芯片对RU486、P4+RU486不同干预下Ishikawa细胞基因表达进行高通量检测,鉴定出其变化敏感的基因,接受最大错误发现率为10%即q=0.01,并以平均最小1.5倍变化作为基因差异表达的评价标准2.观察P4、P4+RU486对Ishikawa细胞中的PR、敏感基因蛋白及mRNA表达的影响Ishikawa细胞培养致细胞亚融合状态后,用17p-estradiol(10-8M)继续诱导72小时,随后分别采用梯度浓度P4单独干预、梯度浓度RU486添加至P4(固定浓度,10-8M)混合干预培养细胞各48小时。0.1%浓度DMSO作为低水溶性化学物的溶剂,一并干预作为阴性对照。采用RT-qPCR检测各干预组PR及最敏感基因：mRNA的表达。EC50值描述及“S函数”量效曲线建立同前。蛋白表达水平采用Westernblotting检测。3.其它待测物质对Ishikawa细胞中的敏感基因mRNA表达的影响Ishikawa细胞生长至亚融合状态后之后用17β-estradiol(10-8M)继续诱导72小时,ZK137316、醋酸乌利司他(UPA)、4-NP、BPA及自然物质芹菜素(Apigenin)以不同浓度(10-4-10-12M)与Progesterone(固定浓度,10-8M)分别混合干预培养细胞各48小时。采用RT-qPCR检测各干预组最敏感基因mRNA的表达。EC50值描述及“S函数”量效曲线建立同前。实验结果1. Affymetrix芯片上28869个基因中共发现有69个基因在接受P4+RU486十预后与P4干预相比差异表达。雌激素硫酸基转移酶(SULT1E1)变化倍数位居第一位。2.P4单独干预下,PRmRNA呈现浓度依赖性下调表达,SULT1E1mRNA呈现浓度依赖性上调表达。孕酮对PRmRNA的下调及SULT1E1mRNA的上调在RU486干预下受到浓度依赖性的拮抗。ZK137316、UPA,4-NP, bisphenol A以及Apigenin培养组组中受拮抗并呈现浓度依赖性。0.1%DMSO于预下,对PRmRNA、SULT1E1mRNA的表达没有变化。WesternBlotting结果显示,和0.1%DMSO对照组相比,P4单独干预下,PR蛋白表达减少、SULT1E1蛋白表达增加。而P4+RU486混合干预下PR蛋白表达增加、SULT1E1蛋白表达增加减少,差异具有统计意义(P<0.05)。3.在ZK137316、UPA、4-NP、BPA、API干预下P4对SULT1E1mRNA的上调性表达都产生了浓度依赖性的拮抗,并且能够建立“S函数”量效曲线。UPA(EC50=9.0×10-10M)、ZK137316(EC50=6.5×10-9M)表现出对SULT1E1表达较强的拮抗作用。4-NP(EC50=3.4×10-6M), BPA(EC50=7.5×10-6M)、API(EC50=9.8×10-7M)则表现出对SULT1E1表达较弱的拮抗作用。实验结论1.本实验证明Ishikawa细胞模型不仅能检测化合物是否具有(抗)激素样作用,还能区分不同化学物(抗)激素样作用的强、弱。2. SULT1E1是Ishikawa细胞在抗孕激素干预下高敏感变化基因之一,可作为检测(抗)孕激素样作用化学物的生物标志物。3."Feasibility Study"中的双酚A、4-壬基酚具备(抗)孕激素样作用。