红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是重要海水养殖优良鱼种之一,由于肉嫩、味鲜、营养好深受国内外消费者的喜爱。近年来,红鳍东方鲀养殖规模及养殖密度逐步扩大,导致鱼类的发病几率随之增大。目前,用抗生素来治疗疾病是最普遍的方式,但是使用抗生素不仅会使鱼体产生抗性,而且还会带来食品安全和生态安全问题等问题。随着人类生活水平的提升,食品的安全性是决定该食品的市场前景的主要因素,因此采用生物防治的方法来提高鱼类自身免疫能力十分必要。不同物种的重组白介素2产品研究已十分广泛,例如重组人类白介素2已被应用到临床实践中,鸡鸭等禽类也有许多重组蛋白的问世。但是重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的研究较少。本文以红鳍东方鲀IL-2基因为基础,分别针对大肠杆菌和毕赤酵母进行密码子优化,分别针对pET-32a(+)和pPICZα-A载体设计酶切位点、信号肽识别位点、标签序列和终止密码子等,人工合成基因序列。本研究分别使用原核表达和真核表达两种方法获得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白。原核表达中选用大肠杆菌BL-21(DE3)作为宿主菌株,将重组表达载体pET-32a(+)-IL-2转化至宿主菌体后,37℃培养菌液至其OD值为0.4-0.6左右,低温缓慢诱导过夜(IPTG浓度1mM/ml),所得重组蛋白为可溶性蛋白且分子量与预期大小相符(32.5KDa)。利用组氨酸标签与镍离子之间高度亲和,高浓度的咪唑可与组氨酸标签竞争结合镍离子的原理纯化重组蛋白。肠激酶酶切重组蛋白,最适酶切条件为每mg蛋白IU肠激酶,37℃酶切16小时。真核表达中选用的是毕赤酵母GS115作为宿主菌株,将重组表达载体pPICZα-A-IL-2通过电转化的方法转化至GS115菌株感受态细胞中,用含不同浓度zeocin的平板选择高拷贝菌株,将其在28℃培养至OD600至2-6左右后更换培养基,同样温度条件下培养,每隔24小时向培养基中添加一次甲醇,经过条件优化后发现,甲醇终浓度为1.5%,诱导96小时表达量可达到最大,所得蛋白分子量大小约为14KDa。通过MTT法鉴定重组蛋白生物学活性。结果显示,两种方法得到的重组蛋白均能够在体外促进小鼠T淋巴细胞(CTLL-2)的增值,原核表达所得重组蛋白经纯化后生物学活性最高,酶切后的样品次之;真核表达所得重组蛋白经浓缩后生物活性最高。原核表达制备重组蛋白具有成本低、操作简便、耗时短等优势,因此本研究中选择原核表达的重组蛋白进行免疫应答实验。两实验组样品浓度分别为0.025ug/ul和0.05ug/ul,PBS作对照,每尾注射200ul。免疫后在不同时间点采集鱼类的主要免疫器官—肾脏作为实验组织,运用实时定量的方法检测注射后不同时间肾脏IL-2、IL-15、MHCI、STAT2基因的表达量的变化情况。结果显示,用重组蛋白免疫鱼体后,上述基因均呈上调表达。