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骨缺损畸形是骨科和颌面外科临床常见病症，采用组织工程方法构建复合种子细胞、支架材料和生长因子的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。本实验主要在如何保持并尽可能延长生长因子的生物活性方面作了一些研究：首先对重组人骨形成蛋白—2(rhBMP-2)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和分化的效应进行研究，以寻找理想的应用方式而获得大量的种子细胞。其次制备聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球作为rhBMP-2的载体，观察其对骨髓间充质干细胞的生物学效应，明确其对rhBMP-2的缓释效果。最后构建以胶原为载体缓释rhBMP-2复合BMSCs及珊瑚的组织工程骨，观察其异位成骨及修复动物颅骨极限缺损的能力，以证实胶原的缓释效果以及胶原和BMSCs对促进成骨的重要意义。 第一部分 rhBMP-2及rhbFGF对骨髓间充质干细胞生物学效应的实验研究 实验一 rhBMP-2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞增殖效应的实验研究 [摘要] 目的：检测rhBMP-2和rhbFGF单独、联合及序贯作用对兔骨髓 第四军医大学博士学位论文间充质干细胞(BMSCS)增殖的效应。方法:采用MTT法检测单独、联合及序贯施加rhBMP一2和rhbFGF后，BMSCs在第1，3，5，7及10天增殖的状况，并进行统计学分析。结果:thBMP一2和rhbFGF均能显著地促进BMSCs的增殖，并呈剂量依赖性。两种生长因子联合作用的效应高于单独或序贯作用的效应。结论:不同生长因子的不同应用方式对BMSCs增殖的效应不同。实验二rhBMP一2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞分化效应的实验 研究{摘要1目的:检测rhBMP一2和thbFGF单独、联合及序贯作用对兔BMSCS分化的效应。方法:采用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒及考马斯亮兰测定法检测单独、联合及序贯施加rhBMP一2和rhbFGF后，BMSCs在第2、5、7及10天时的ALP活性及蛋白质含量水平以反映对细胞分化作用的影响，并进行统计学分析。结果::hBMP一2能在较长时间内明显促进细胞ALP活性及蛋白质含量，而:hbFGF则起到抑制作用，且均呈剂量依赖性。rhBMP一2单独作用与两种生长因子联合作用的效应相近，且均高于thbFGF单独作用或两种因子序贯作用的效应。结论:不同生长因子的不同应用方式对BMSCS分化的效应不同。第二部分rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球缓释系统对 骨髓间充质干细胞的生物学效应的实验研究实验一rbBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球的制备及性质鉴定【摘要1目的:制备rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁醋纳米微球缓释系统，并对其性质进行鉴定。方法:根据正交设计法优化制备工艺，采用改良的乳化溶液聚合法制得rhBMP一2纳米微球。采用多种方法对该纳米微球的形态学、包裹率、异位诱骨活性、释药性、稳定性和再分散性进行检测。结果:该纳米微球形态规整，粒径在纳米级，对thBMP一2的包裹率约为第四军医大学博士学位论文69.7%，具有异位诱骨活性，在体外对rhBMP一2具有缓释效果，稳定性和再分散性好。结论:该纳米微球性质优良，可作为:hBMP一2的缓释载体。实验二rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球缓释系统对骨髓间充质 干细胞增殖及分化作用的实验研究l摘要】目的:检测thBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球缓释系统对兔BMSCS增殖和分化作用的效应。方法:在rhBMP一2纳米微球作用于BMSCS后，采用MTT法和A叨ORs染色法检测细胞的增殖状况，采用ALP试剂盒检测细胞的ALP活性以反映其分化状况，采用透射电镜观察细胞的超微结构，并与单纯:hBMP一2的作用进行比较。结果:该纳米微球缓释系统能显著促进BMSCS的增殖及分化，并呈剂量依赖性。其效应高于单纯施加thBMP一2的效应。该纳米微球作用细胞后，超微结构显示细胞处于旺盛的分裂增殖状态。结论::hBMP一2纳米微球缓释系统促进BMSCs增殖分化的作用明显优于单纯thBMP一2的作用。实验三rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁醋纳米微球缓释系统对骨髓间充质 干细胞成骨标志蛋白的实验研究I摘要1目的:探讨thBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球缓释系统作用BMSCS后对成骨标志蛋白及其mRNA水平表达的影响。方法:1.采用免疫细胞化学染色及图像分析方法，观察thBMP一2纳米微球作用后对细胞中骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素及I型胶原表达的影响;2.采用反转录PCR方法，观察rhBMP一2纳米微球作用后对细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原mRNA水平表达的影响，并与单纯thBMP一2作用细胞后的结果进行比较。结果:rhBMP一2纳米微球作用后细胞中骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素及I型胶原的表达以及骨钙素、碱性磷酸酶及1型胶原mRNA水平的表达均明显强于单纯thBMP一2作用后的效果。结论:rhBMP一2纳米微球缓释系统促进BMSCS向成骨方向分化的作用强于单纯thBMP一2的作用。 第四军医大学博士学位论文实验四rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁酷纳米微球缓释系统对成骨细胞钙 结节的影响l摘要l目的:观察rhBMP一2聚氰基丙烯酸正丁醋纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节