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研究背景:2018年全球185个国家的癌症数据统计显示,在女性癌症患者中卵巢癌的发生率和死亡率均位居第八位。与此同时,卵巢癌作为威胁女性健康的生殖系统肿瘤之一,其在生殖系统肿瘤中致死率高居首位。由于卵巢癌起病隐蔽,确诊时约60%的患者已是癌症晚期,主要依靠手术治疗联合以铂类和紫杉醇类为主的化疗药物进行治疗,而卵巢癌患者容易对化疗药物产生耐药性,影响化疗效果进而导致不良预后。因此,急需寻求新型有效的化疗药物成为目前卵巢癌治疗中亟待解决的重要问题之一。目的:我们前期研究发现提取于山竹果皮的一种单体化合物SZ-NCI-C对卵巢癌细胞系具有显著的增殖抑制作用,因此,在本论文中我们通过动物模型和细胞模型探讨该单体化合物的抗卵巢癌作用。方法:1、皮下移植瘤模型和SZ-NCI-C抗卵巢癌的体内研究:构建人卵巢癌细胞系Hey A8的裸鼠皮下移植瘤模型,每三天腹腔给药SZ-NCI-C一次,持续监测裸鼠体重和移植瘤体积变化,实验结束后取瘤称重,进行统计分析,揭示SZ-NCI-C对Hey A8裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。2、MTS细胞增殖实验:用梯度浓度的SZ-NCI-C分别处理人卵巢癌细胞系Hey A8、SKOV3和小鼠卵巢癌细胞系ID8-luc-sort,24、48和72小时后加入Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent检测吸光度值,验证SZ-NCI-C对卵巢癌细胞增殖活力的抑制作用。3、平板克隆形成实验:用梯度浓度的SZ-NCI-C分别处理卵巢癌细胞Hey A8、SKOV3和ID8-luc-sort,检测SZ-NCI-C对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响;软琼脂克隆形式实验:用梯度浓度的SZ-NCI-C处理软琼脂中生长的Hey A8细胞,揭示SZ-NCI-C对卵巢癌细胞锚定非依赖性生长能力的影响。4、流式细胞术细胞周期实验:用梯度浓度的SZ-NCI-C分别处理Hey A8和SKOV3细胞24、48和72小时,采用PI染色细胞周期检测试剂盒检测SZ-NCI-C对卵巢癌细胞的细胞周期调控作用。5、细胞衰老实验:用梯度浓度的SZ-NCI-C分别处理Hey A8和SKOV3细胞10天,使用β-半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒检测SZ-NCI-C对卵巢癌细胞中β-半乳糖苷酶活性的影响,由此推测SZ-NCI-C对卵巢癌细胞衰老的影响。6、Western blot蛋白表达水平检测:为探究SZ-NCI-C抗卵巢癌的作用机制,我们用梯度浓度的SZ-NCI-C分别处理Hey A8和SKOV3细胞24、48和72小时,再采用Western blot检测SZ-NCI-C处理对卵巢癌细胞中多种信号通路相关蛋白表达水平的影响。7、MDC自噬小体数量检测:基于Western blot实验发现的SZ-NCI-C对细胞自噬相关蛋白表达的调控作用,进一步用梯度浓度的SZ-NCI-C处理卵巢癌细胞Hey A8和SKOV3,进行MDC染色,探索SZ-NCI-C对卵巢癌细胞自噬小体数量的影响。结果:1、人卵巢癌细胞系Hey A8裸鼠皮下移植瘤给药实验结果显示,SZ-NCI-C处理组的裸鼠皮下移植瘤体积明显小于溶剂对照组和阳性化疗药物顺铂组的裸鼠皮下移植瘤体积;SZ-NCI-C处理组的移植瘤重量也显著小于溶剂对照组的移植瘤重量;SZ-NCI-C处理对裸鼠体重的影响与对照溶剂和阳性化疗药物顺铂处理无显著差异。由此可见SZ-NCI-C给药可以显著抑制人卵巢癌细胞系Hey A8裸鼠皮下移植瘤的生长,并且对裸鼠的毒副作用较小。2、MTS细胞增殖实验结果显示,SZ-NCI-C显著抑制卵巢癌细胞的增殖活力,并且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性,SZ-NCI-C处理时间越久,SZ-NCI-C处理浓度越高,对细胞增殖活力的抑制作用越明显。3、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验显示,SZ-NCI-C处理浓度越高,卵巢癌细胞形成的克隆团块越小,提示SZ-NCI-C显著抑制卵巢癌细胞的平板克隆形成能力和锚定非依赖性生长能力。4、细胞周期实验结果显示,SZ-NCI-C导致卵巢癌细胞Hey A8的细胞周期明显阻滞在G2/M期,SKOV3的细胞周期明显阻滞在S期,并且随SZ-NCI-C处理时间越久,SZ-NCI-C处理浓度越高,对细胞周期的阻滞作用越明显。5、β-半乳糖苷酶细胞衰老检测发现,随着SZ-NCI-C处理浓度的升高,更多的Hey A8细胞中β-半乳糖苷酶活性升高,被染成蓝绿色,但是SKOV3细胞几乎没有被染色,由此推测SZ-NCI-C诱导卵巢癌细胞Hey A8发生细胞衰老,然而,是否引起SKOV3细胞衰老有待进一步实验探讨。6、Western blot实验结果显示,SZ-NCI-C处理能导致卵巢癌细胞Hye A8和SKOV3中的CDK2、CDK4、CDK7、p27、Cyclin D3、GSK-3β和p-GSK-3β等细胞周期相关蛋白的表达水平与对照组相比均有显著差异,提示SZ-NCI-C可能通过调控这些细胞周期相关蛋白的表达进而阻滞细胞周期并抑制卵巢癌细胞增殖。7、Western blot实验结果显示,SZ-NCI-C处理能导致Hey A8和SKOV3细胞中的Beclin-1、LC3A/B-II和Atg7等蛋白表达水平均呈升高趋势,提示SZ-NCI-C调控细胞自噬。另外,SZ-NCI-C还能影响其它重要信号通路蛋白的表达水平,例如导致TIMP2、Rac1/2/3、Claudin-1和CD44蛋白表达水平升高。8、MDC细胞自噬实验结果显示,用不同浓度的SZ-NCI-C不显著诱导Hey A8和SKOV3细胞中自噬小体数量的增多。Western blot结果提示SZ-NCI-C影响细胞自噬,然而MDC实验排除了SZ-NCI-C对卵巢癌细胞自噬小体数量增加的影响,SZ-NCI-C如何影响细胞自噬有待通过其它实验方法进一步探究。结论:我们发现SZ-NCI-C显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制卵巢癌细胞的增殖活力和克隆形成能力,阻滞细胞周期,诱导Hey A8细胞衰老。Western blot实验发现SZ-NCI-C影响周期相关蛋白、细胞自噬相关蛋白和其它一些重要通路蛋白的表达。上述研究结果表明SZ-NCI-C可作为一种潜在候选药物用于卵巢癌化疗药物的研发。