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背景：癌干细胞(cancer stem cells, CSCs)是肿瘤组织中存在少数类似于干细胞的肿瘤细胞,其具有自我更新、多向分化潜能及无限增殖能力并能形成异质性肿瘤,在肿瘤形成、生长、耐药、转移及复发中扮演着重要的角色。癌干细胞与肿瘤细胞相比,不同之处在于其具有高致瘤性和耐药特性,能够逃脱化疗药物治疗的损伤,并能够在机体内迁移形成新的与原发肿瘤性质相似的肿瘤组织,因此被认为是肿瘤的恶性之源。从事癌干细胞研究的重要前提是从肿瘤组织或肿瘤细胞中获取癌干细胞,然而癌干细胞在肿瘤组织或肿瘤细胞中所古比例极少,如何获得癌干细胞是目前癌干细胞研究迫切需要攻克的难题,需要大量的实验研究寻找富集纯化癌干细胞的有效手段。在肝癌研究中,本课题组前期针对癌干细胞的耐药特性,通过化疗药物体外及裸鼠体内干预富集人肝癌细胞系BEL-7404中的癌干细胞特性细胞群,但癌干细胞比例仍然较低,需要联合其他富集癌干细胞的方法进一步富集及纯化,进而提高人肝癌细胞系BEL-7404中的癌干细胞比例,为进行后续的癌干细胞实验研究提供前期基础。目的：通过癌干细胞的耐药特性联合单个细胞克隆培养的方法,以期进一步富集肝癌干细胞,为进行后续的癌干细胞实验研究提供前期的实验基础。方法：选取人肝癌BEL-7404细胞系为研究对象,通过体内化疗压力初步筛选肝癌干细胞群体,联合体外单细胞克隆培养方法,建立富集肝癌干细胞模式,主要构建模式如下：(1)裸鼠体内初筛肝癌干细胞：建立人肝癌细胞系BEL-7404裸鼠皮下移植瘤动物模型,采用阿霉素(8mg/kg)每周一次尾静脉注射,待肿瘤直径为1.5cm时取材进行原代培养,并在体内连续传代4次。(2)单细胞克隆培养富集肝癌干细胞：取经体内连续传代4次并结合阿霉素干预的肝癌细胞,命名为BEL-7404-ADM-P4,采用有限稀释法进行单细胞克隆培养,12～14天后在倒置显微镜下观察,根据形态分类,将克隆分为三种类型,即全克隆、部分克隆和旁克隆。肝癌干细胞富集模式的富集效率检测：(1)单个细胞克隆形成实验；(2)单克隆细胞生长曲线；(3)“悬浮球”培养情况,即干细胞培养基中球囊形成情况；(4)Hoechst33342外排情况；结果：将BEL-7404细胞种植于裸鼠腋窝皮下,形成异种移植瘤,体内连续传四代并结合化疗药物干预,获得经阿霉素富集的第四代肝癌细胞BEL-7404-ADM-P4细胞。BEL-7404-ADM-P4细胞相对于BEL-7404亲本细胞,其体外克隆增殖能力较强,克隆形成率为(67.38±1.72)%；而BEL-7404亲本细胞的克隆形成率是(32.78±9.03)%。BEL-7404-ADM-P4细胞进行单细胞克隆培养,将其所形成的单细胞克隆中全克隆、部分克隆和旁克隆分别表示为BEL-7404-ADM-P4-HC、BEL-7404-ADM-P4-MC和BEL-7404-ADM-P4-PC,它们所占百分比分别是(15.90±2.81)%、(38.30±+6.59)%、(45.80±7.71)%,将BEL-7404-ADM-P4-HC进行传代,其克隆形成率是(79.75±5.62)%,BEL-7404-ADM-P4-HC传代形成的单细胞克隆中全克隆、部分克隆和旁克隆所占百分比分别是(38.22+8.47)%、(45.74+10.92)%、(16.04±10.33)%；将BEL-7404-ADM-P4-MC传代,其克隆形成率是(78.89+15.17)%,BEL-7404-ADM-P4-MC传代形成的单细胞克隆只有部分克隆和旁克隆两种类型的克隆,它们所占百分比分别是(75.56+4.45)%、(24.44+4.45)%。而BEL-7404亲本细胞进行单细胞克隆培养,其所形成的单细胞克隆中全克隆、部分克隆和旁克隆所占百分比分别是(7.12±2.96)%、(62.67±13.39)%、(30.21±14.87)%。BEL-7404-ADM-P4细胞经单细胞克隆培养形成的全克隆细胞能在低粘附孔板中用干细胞培养基培养时形成球囊,而部分克隆细胞在低粘附孔板中用干细胞培养基培养时不能形成球囊。BEL-7404-ADM-P4细胞进行单细胞克隆培养形成的全克隆细胞用荧光染料Hoechst33342染色,出现部分没有发出荧光的细胞,部分克隆和旁克隆细胞均发出荧光；而BEL-7404亲本细胞进行单细胞克隆培养形成的全克隆、部分克隆和旁克隆细胞均发出荧光,且三种类型克隆的荧光强度均比BEL-7404-ADM-P4细胞形成的三种类型克隆的荧光明显增强。结论：裸鼠皮下移植瘤传代同时给予阿霉素干预联合体外单细胞克隆培养法的富集模式,形成的全克隆中可有效富集人肝癌细胞系BEL-7404细胞中的癌干细胞特性细胞群体。