创伤弧菌（Vibrio Vulnificus）FJ03-X2菌株为本研究室分离、鉴定、保种,属于创伤弧菌Ⅰ型菌株,是欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的致病菌。该菌株具溶血活性和酪蛋白酶活性,对欧鳗幼鳗（约30克/尾）的半数致死剂量(LD₅₀)约为7.1×10³CFU/尾,并已利用16S rDNA序列比较分析及创伤弧菌溶血素特异性Nested-PCR进行了联合鉴定。首先本研究分别采用不同的方法分离创伤弧菌外膜蛋白（outer membraneproteins,OMP）,比较了各种方法的提取效果,筛选最佳的创伤弧菌外膜蛋白提取方法。制备了兔抗创伤弧菌FJ03-X2全菌血清,并应用SDS-PAGE和Western-blotting分析比较了两种方法提取的外膜蛋白的组分和抗原性。SDS-PAGE结果表明,Sarkosyl法分离的主要外膜蛋白相对分子量集中在66～14kDa之间;相对分子量为38kDa、36kDa的外膜蛋白为高丰度蛋白。用兔抗全菌高免血清进行的Western-blotting结果显示,抗血清能识别绝大多数外膜蛋白组分,说明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中相对分子量分别为66kDa、47kDa、44kDa、38kDa、36kDa、34kDa的外膜蛋白呈强阳性反应,是主要的免疫原组分。同时对创伤弧菌在不同培养条件下的外膜蛋白产量进行了比较分析,结果说明创伤弧菌外膜蛋白产量与温度和时间存在直接相关性。其次本研究制备出创伤弧菌外膜蛋白（OMP）免疫刺激复合物（ISCOMs）亚单位疫苗,腹腔注射免疫欧鳗,间接ELISA法测得免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d所采集的血清抗体效价分别为1:100、1:3200、1:6400、1:12800、1:3200、1:1600,欧鳗的血清抗体应答水平先呈现上升趋势,免疫后第28d达到峰值,之后开始下降;但是在第42d仍能检测到相应抗体。同时在第28d用创伤弧菌进行攻毒,OMP-ISCOMs免疫组的免疫保护力可达到100%;而OMPs免疫组的免疫保护力为70%;对照组全部死亡;说明OMP-ISCOMs具有很强的免疫原性,能诱导欧鳗产生较高的免疫保护性。这与第28d欧鳗血清抗体水平最高也是一致的。免疫印迹结果显示,在印迹膜上对应的位置可检测到OMP的4条主要蛋白条带且免疫反应性强,其相对分子量分别为47kDa、38kDa、36kDa、34kDa。上述试验结果提示,创伤痪饽さ鞍资侵匾谋；ば钥乖?在制备成ISCOMs亚单位疫苗的情况下,较小的剂量单次免疫即可起到显著的免疫保护效果。第三为了进一步探讨不同弧菌间是否存在具有共同特性的外膜蛋白,我们对Sarkosyl法分离的创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）的外膜蛋白（OMP）进行了初步的比较分析。这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异。SDS-PAGE显示,四种弧菌中除副溶血弧菌外都能分离到47kDa、38kDa的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,相对分子量为47kDa、40kDa、38kDa、36kDa;溶藻弧菌和鳗弧菌有75kDa、47kDa、43kDa、38kDa的4种共同的外膜蛋白。制备了兔抗创伤弧菌外膜蛋白高免血清,间接ELISA测定血清效价为1:51200。用该抗血清进行免疫印迹的结果显示,兔抗创伤弧菌外膜蛋白血清能与创伤弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌外膜蛋白、鳗弧菌外膜蛋白进行免疫反应,其中与溶藻弧菌外膜蛋白的反应性相对较强,有三条清晰的反应发色带,相对分子量为38kDa、30kDa、29kDa;同时抗血清与嗜水气单胞菌外膜蛋白无反应带;而38kDa的外膜蛋白是创伤弧菌和溶藻弧菌共同的免疫反应带;说明这两种弧菌可能有共同的保护性抗原。本研究对创伤弧菌的培养条件和外膜蛋白的提取方法进行了探讨,筛选出最佳的培养温度和时间以及提取方法;通过实验分析了创伤弧菌外膜蛋白的抗原性和免疫原性;并进一步证实了创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物疫苗能够诱导欧洲鳗鲡产生良好的免疫保护性,为研制创伤弧菌亚单位疫苗奠定了基础;同时还为寻找不同弧菌间共同的外膜蛋白抗原进行了有益的尝试。