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本课题围绕“动物源病原体的发现及其对人类致病性”这一科学问题,以我国青藏高原喜马拉雅旱獭呼吸道携带的病原体谱系为研究目标,将现场流行病学调查与实验室检测分析相结合,采用PacBio高通量测序技术、微生物培养组学技术和未知新病原鉴定技术相结合,对喜马拉雅旱獭呼吸道菌群开展研究,分离获得三个链球菌新种,分别命名为旱獭链球菌(Streptcoccus marmotae sp.nov.),喜马拉雅链球菌(Streptcoccus himalayana sp.nov.)和耐盐链球菌(Streptcoccus halotolerans sp.nov.)。通过研究初步了解了喜马拉雅旱獭呼吸道菌群分布特征;明确了三个链球菌新种的准确分类地位以及与近源种的生物系统学关系;并对其全基因组特征、毒力相关因子开展了比较基因组学的分析。本课题对喜马拉雅旱獭呼吸道样本采用扩增16S rRNA序列,然后克隆转化,blast比对,对其呼吸道菌群展开分析。结果表明:链球菌属是喜马拉雅旱獭呼吸道的主要菌群,占菌群结构的49.8%;其次为埃希菌属和韦荣菌属,分别占菌群结构的11.1%和8.5%;此外,在所有未知新种的克隆中,疑似链球菌属新种的克隆数占69.1%,提示喜马拉雅旱獭呼吸道菌群中分布大量未知链球菌新种,为进一步分离培养提供了理论依据。以此为线索,我们应用微生物培养组学方法对75份喜马拉雅旱獭气管黏膜标本进行筛查,成功分离到三个疑似链球菌新种。经形态学观察、生化反应比较,并结合分子生物学鉴定,该三个未知新种均归属为链球菌属,根据三个未知新种的特征,依照国际微生物命名标准,分别将其命名为旱獭链球菌(S.marmotae sp.nov.),喜马拉雅链球菌(S.himalayana sp.nov.)和耐盐链球菌(S.halotolerans sp.nov.)。三个链球菌新种在血平板上37℃培养24 h后形成直径0.5-1.0 mm,灰白色、圆形隆起、湿润、边缘整齐的针尖状菌落,a溶血。单个菌体呈圆形或椭圆形,数个菌体排列呈链状,革兰染色阳性,无芽胞,无鞭毛。三个链球菌新种均在22、30、37、42°C培养时生长,4°C、15°C时不生长。其中喜马拉雅链球菌和旱獭链球菌在含2.5%NaCl的脑心羊血培养基上生长,在含4.5%、6.5%NaCl的脑心羊血培养基上不生长。但是耐盐链球菌在含9.0%NaCl的脑心羊血培养基上仍可以生长。三个链球菌新种的生化反应结果明显区别于同属内其他近源种。基于16S rRNA序列、3个保守基因(sodA、rpoB和groEL)和全基因组的系统发生关系分析表明,旱獭链球菌与S.suis,S.ovis和S.minor亲缘关系较近,归属为链球菌属猪链群;喜马拉雅链球菌与S.acidominimus,S.cuniculi和S.marmotae有较近的进化关系,也属于链球菌属猪链群;耐盐链球菌与变异群的S.thoraltensis,S.hyovaginalis聚在一起,归属为链球菌属变异群。通过与GenBank中其他链球菌已知种进行DNA-DNA在线杂交,发现三个链球菌新种与其他链球菌已知种相似性均低于70%。旱獭链球菌基因组全长2,322,791 bp,G+C含量为41.6 mol%,编码2,377个基因,携带58个tRNAs,12个rRNAs,2个质粒(大小分别为3,762 bp和5,997bp),11个基因组岛。喜马拉雅链球菌基因组全长2,275,471 bp,G+C含量为41.3mol%,编码2,195个基因,携带57个tRNAs,12个rRNAs,6个基因组岛。耐盐链球菌基因组全长1,823,556 bp,G+C含量为39.9mol%,编码2,068个基因,携带68个tRNAs,18个rRNAs,9个基因组岛。通过将三种链球菌新种的基因组序列与VFDB数据库收录的毒力基因进行BLAST比对分析,结果表明Has(Hyaluronic acid capsule),ClpC(Caseinolytic protease C)和ClpE(Caseinolytic protease E)是三个链球菌新种共有的毒力因子;作为肺炎链球菌主要侵袭力的表面黏附素PsaA(pneumococcal surface adhesin A)和PavA(pneumococcal adherence and virulence factor A),在旱獭链球菌和喜马拉雅链球菌中都存在;除此以外,VFDB数据库中编码细胞毒素、自溶素的基因在三个链球菌新种基因组中也存在,三个链球菌新种是否对动物和人具有致病性,其致病机制如何,是我们接下来要进行的课题研究。