腹泻是人类常见病，尤其多发于婴幼儿时期。A组轮状病毒(rotavirusRV)是全世界婴幼儿非细菌性腹泻的主要病毒病原，全世界每年大约有60万5岁以下的儿童的死亡与RV感染有关，而目前对RV引起的婴幼儿感染性腹泻尚无特效疗法。我们在研究中分离到具有高效、低毒的抗病毒活性物质，已经通过硅胶柱层析和制备型高效液相色谱得到了抗病毒活性物质的纯品，命名为Jn219。Jn219极性较强，在220nm处有最大紫外吸收，质谱(ESI)测得该化合物分子量为519道尔顿。本文以轮状病毒为病原，研究了Jn219的体内、体外抗病毒的活性，为Jn219临床应用奠定基础。 目的 探讨Jn219体内、外抗病毒效果。本课题是在初步发现真菌提取物体外具有高效抗病毒活性基础上，进行活性物质体外抑毒实验、体内抗病毒效果的研究。 方法 1Jn219体外抑制RV效果的研究：将Jn219自50ug/ml始做5倍比稀释，然后与等容量(100个TCID50)的RV病毒液作用1h，依次横向接种于96孔板内MA104单层细胞上，相同稀释度纵向重复3孔，然后以100个TCID50的病毒(RVSA11)攻击，同时设有药物毒性试验组、病毒对照和细胞对照组，于37℃、5％CO2温箱培养，逐日观察细胞病变，病毒对照组细胞病变作为参照，实验终止时用中性红染色、分光光度计在540nm波长测定OD值，按Reed-Muench法计算药物细胞毒性、药物半数有效浓度、半数细胞中毒浓度，并且计算药物抑毒指数。 2Jn219动物体内抗RV效果的研究： 2.12-3日龄乳鼠50只，随机留取10只做正常对照，为正常对照组(简称正常对照组)，接种等容量细胞维持液，其余40只随机分为2组，分别接种病毒悬液20μl/只(20只)、50μl/只(20只)后，各平均分为2组，一组为病毒感染模型组(简称感染模型组)。一组给予Jn219治疗，为感染模型治疗组(简称治疗组)，初次给药时间为接种病毒后1h，给药方法为2μl/次，2次/天，给药途径为自然吮吸法。因此，这50只乳鼠被随机分成5组，10只/组，分别为正常对照组、感染模型组(20μl、50μl各一组)、感染模型治疗组(20μl、50μl各一组)。 2.2每天观察乳鼠的一般情况(体重、活动等)、腹泻、死亡情况。 2.3感染4天时，取乳鼠小肠用10％甲醛溶液固定，常规切片，HE染色观察肠组织病变，免疫组化方法检测不同组乳鼠肠黏膜上皮细胞及其脱落上皮胞浆内RV抗原的表达，实时荧光定量PCR探讨该物质是否抑制病毒在模型动物肠粘膜上皮的增殖或抑制病毒蛋白的表达。综合上述检测结果判断Jn219口服抗RV肠道感染的疗效。 结果： 1Jn219体外抑制RV的效果 1.1药物半数细胞中毒浓度(ED50)：在1：5(即50ug/ml)时，细胞存活率为70％，即，半数中毒浓度小于1：5。 1.2半数有效浓度(IC50)为1：384.92。 1.3抑毒指数：TI=ED50/IC50=0.2/0.0026=76.92，由于ED50小于1：5，因此，抑毒指数应该大于76.92。 2Jn219动物体内抗RV的效果 2.1正常对照组：乳鼠活跃、无腹泻现象，96h时死亡1只。病理切片显示，乳鼠肠上皮细胞结构清晰，细胞核位于肠上皮细胞的基低部，排列规则。免疫组化均显示阴性结果。实时荧光定量PCR表明小肠绒毛上皮细胞内无RV复制。 2.2感染模型组：感染RV24h时，乳鼠出现腹胀、腹泻，20μl、50μl感染组各死亡1只；72h时，存活动物皮肤出现皱褶、精神萎靡，50μl感染组死亡2只；96h时，20μl病毒组共死亡3只(死亡率为40％)，50μl病毒组共死亡4只(死亡率为50％)。病理学检测发现动物小肠黏膜肿胀、炎性细胞浸润、黏膜上皮细胞片状变性坏死脱落，肠腔内有大量渗出物(HE染色呈红色)。免疫组化结果显示肠绒毛上皮细胞浆有深棕黄色颗粒沉淀。实时荧光定量PCR表明RV在50μl感染组小肠中的浓度最高，平均为3.35×107copy/ml，在20μl感染组中的浓度次之为3.01×105copy/ml。 2.3感染模型治疗组：治疗组动物(2组)于接种RVSA1124h时出现腹胀，无明显腹泻，各死亡1只乳鼠；72h时皮肤出现皱褶、精神萎靡，50μl感染治疗组死亡1只；96h时，2组分别死亡2只乳鼠(死亡率为20％)。病理检查发现病毒模型治疗组动物有黏膜肿胀和轻度炎性细胞浸润，但无明显黏膜变性、坏死脱落，肠腔内无渗出物(HE染色)。免疫组化结果显示，治疗组小肠绒毛上皮细胞浆内有淡棕黄色沉淀或无明显棕色沉淀。荧光定量PCR结果显示，50μl感染治疗组小肠中RVSA11的平均浓度为3.7×105copy/ml，20μl感染治疗组中病毒的平均浓度为9.05×103copy/ml。经统计学处理与相应病毒对照组有显著差异(P＜0.01)。 结论 1Jn219在体外具有抑制RVSA11在MA104细胞病变发生的作用。 2Jn219在体内可以缓解RVSA11感染引起的乳鼠腹泻，降低乳鼠病死率、能提高小肠吸收功能，减轻RV引起的肠道病理性变化、具有抑制RV在小肠粘膜的复制作用。