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目的：Wnt蛋白家族包括多个成员且序列和信号传导方式高度保守,在调控胚胎发育中起重要作用,Wnt5a是其家族成员之一,该基因在各类肿瘤中的作用是近年关注的热点之一。与Wnt5a相关的研究涉及多种肿瘤,并且在不同肿瘤中的表现不一。髓系白血病在中国的发病率持续升高,且国内外罕见Wnt5a与髓系白血病关系的报道,我们前期研究已证明Wnt5a具有抑制白血病细胞株增殖的作用,其表达缺失可能与白血病发生有关,但明确的作用机制尚未深入研究。本研究拟观察髓系白血病病人治疗缓解前后骨髓有核细胞Wnt5a启动子甲基化水平的变化和去甲基化药物对白血病细胞Wnt5a启动子甲基化水平的影响,进一步探讨它表达下调或沉默的机理以及与髓系白血病发生的关系,从而为白血病提供新的肿瘤诊断标志物和基因治疗靶点。方法：1.MSP法检测30例急性髓细胞白血病初诊病例和31例急性髓细胞白血病缓解病例骨髓有核细胞Wnt5a启动子甲基化水平。2.MSP法检测17例慢性粒细胞白血病慢性期病例标本和3例急变期病例标本Wnt5a启动子甲基化水平。3.淋巴细胞分离液和细胞培养技术分离培养髓系白血病原代细胞和骨髓基质细胞,并应用RT-PCR方法检测2例培养的白血病原代细胞和骨髓基质细胞中Wnt5a的表达。4.MSP法检测白血病原代细胞和骨髓基质细胞中Wnt5a启动子甲基化情况。5.MTT法检测不同作用时间点和不同浓度去甲基化试剂Adc处理条件下的各组U937细胞的增殖情况,并确定后期实验的最适药物用量和作用时间。6.去甲基化试剂Adc处理U937白血病细胞株,检测不同药物浓度作用下Wnt5a的表达水平和Wnt5a基因启动子甲基化的水平的差异。7.流式细胞术检测去甲基化试剂Adc处理U937细胞2d后细胞周期的变化情况。结果：1. Wnt5a启动子甲基化情况：30例急性髓细胞白血病初诊病例中22例出现甲基化现象,启动子甲基化率为73.3%(22/30)；31例急性髓细胞白血病缓解病例中3例出现甲基化现象,甲基化率为9.7%(3/31)2.17例慢性粒细胞白血病慢性期病例标本和3例急变期病例标本中,Wnt5a启动子都未见甲基化。3.分离获得悬浮生长的白血病原代细胞和贴壁生长的骨髓基质细胞中,骨髓基质细胞Wnt5a表达阳性,而白血病原代细胞中未检测到Wnt5a表达。4.骨髓基质细胞中Wnt5a启动子没有发生甲基化,而在白血病原代细胞中分别表现为部分甲基化和完全甲基化两种情况。5.不同浓度去甲基化试剂Adc处理U937细胞不同时间,最终确定适用于U937细胞的Adc作用时间为48h,浓度范围为3μmol/L～10μmol/L。6.Adc处理后U937细胞Wnt5a启动子甲基化水平下调,mRNA表达恢复,且在一定浓度范围内,Wnt5a的表达量与Adc药物浓度有关。7.与对照组细胞相比,Adc处理后U937细胞G2期增高,表明Adc处理后,细胞周期被阻滞在G2期。结论：1.Wnt5a启动子甲基化现象在急性髓细胞白血病初诊病例中阳性率为73.3%,明显高于缓解病例阳性率9.7%,证实了我们前期研究发现白血病标本中普遍存在Wnt5a表达缺失是因其启动子异常甲基化所致。2.治疗缓解后Wnt5a启动子甲基化状态明显下降,表明我们前期研究发现治疗缓解病例Wnt5a表达恢复的原因是经治疗去除了其启动子的甲基化状态。研究结果提示Wnt5a启动子的异常甲基化可能与白血病细胞的恶性增殖有关,Wnt5a表达水平变化和启动子甲基化状态可能成为判断病情发展和预后的实验室诊断新指标。3.慢性期和急变期的慢粒病人骨髓有核细胞Wnt5a启动子均未见甲基化现象。前期研究中Wnt5a在慢粒病人和K562细胞中不表达或低表达,在mRNA水平上与在急性髓系白血病中极为类似；但启动子甲基化研究提示Wnt5a在慢粒病人中表达下调原因不同于急性髓细胞白血病,可能受其他机制调节,有待进一步研究。4.白血病病人的骨髓基质细胞中Wnt5a高表达,且启动子未见甲基化,而白血病肿瘤细胞Wnt5a低表达且启动子发生明显甲基化,说明白血病病人骨髓中的基质细胞可能未发生异常,Wnt5a启动子甲基化可能特异的出现在白血病细胞等恶性细胞中,是急性髓细胞白血病中Wnt5a低表达的主要原因。5.去甲基化试剂Adc作用后,白血病细胞U937增殖能力减低,提示Wnt5a的表达可能抑制白血病细胞增殖。6.Adc处理后,Wnt5a表达恢复,U937细胞G2期增高,提示Wnt5a可能将细胞周期阻滞在G2期,细胞不能进行有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖,但去甲基化试剂不能完全改变U937细胞Wnt5a启动子异常甲基化情况,说明仍有其他机制维持白血病细胞的异常甲基化,其具体机制仍需进一步研究。以上研究提示,Wnt5a启动子甲基化水平在急性髓细胞白血病病例中普遍升高,而在治疗缓解病例中降低,印证了前期研究,说明急性髓细胞白血病中Wnt5a启动子甲基化是导致Wnt5a表达缺失的分子机制,而在慢性粒细胞白血病各病程中Wnt5a的表达缺失不由类似的调控因素控制。本组实验与前期研究共同证明Wnt5a在白血病病例中发挥抑癌基因的作用,其表达缺失是白血病发生的机制之一,并受到表观遗传学方法的调节,其中存在“Wnt5a启动子异常甲基化-Wnt5a表达下调-白血病发生”的逻辑联系。