研究背景腰椎间盘突出症是临床上的一种常见疾病,多表现为一侧或双侧肢体的疼痛,严重影响患者的生活质量。磁共振检查发现,在无症状的人群中腰椎间盘突出的比率高达76%,而许多剧烈疼痛的患者却无明显的腰椎间盘突出,仅有神经根增粗、水肿的表现。实验研究也发现腰椎间盘突出症引起患者疼痛的原因,不仅仅单纯是突出的髓核组织对邻近神经根的直接机械性压迫所导致,髓核组织刺激神经根引发的神经根炎也是患者疼痛的主要原因。神经根炎以邻近神经根的炎症为特征,主要表现为受累神经节段的剧烈的肢体疼痛,对患者的生活造成严重影响。神经根炎是造成腰椎间盘突出症患者剧烈疼痛的常见病因之一。临床中常采用类固醇激素椎管内注射和非甾体类消炎镇痛药来治疗神经根炎,可明显减轻患者的根性疼痛,但其不良反应限制了其更广泛的应用。因此许多学者在尝试寻找其他更加安全有效的药物治疗神经根炎。cAMP和cGMP是细胞内关键的第二信使,在细胞信号转导中占重要地位。其浓度调节主要依赖腺苷酸环化酶(AC)/鸟苷酸环化酶(GC)的合成作用及磷酸二酯酶(PDEs)的水解作用来保持动态平衡。PDEs无处不在,其PDEs家族包含21个基因密码。目前,已发现PDEs家族有11个亚型(PDE1 to PDE11),各有其独特的生物特性和组织分布,并具有不同的功能。PDE4抑制剂罗氟司特(Roflumilast)已被批准用于治疗严重的慢性阻塞性肺疾病。PDE5抑制剂西地那非在临床上广泛用于治疗勃起功能障碍。研究发现传统止痛药物可卡因也是一种非选择性PDEs抑制剂。研究显示PDEs家族中多种亚型参与炎症反应。磷酸二酯酶2A(PDE2A)是PDEs家族的一种亚型,具有水解cAMP和cGMP的双重作用,是一种cGMP敏感的PDEs,极微量的cGMP与PDE2A结合后,即可发生构象改变,增强对cAMP的水解能力。PDE2A在体内的分布十分广泛,且近期研究发现PDE2A在哺乳动物大脑和脊髓背角(第Ⅰ和Ⅱ层)中高表达。研究表明PDE2A抑制剂能通过升高cAMP和cGMP,增强长时程突触传递,改善阿尔兹海默症病人和脑老化病人的认知和长期记忆功能,具有神经保护作用;PDE2A抑制剂还能缓解骨性膝关节炎大鼠的炎性疼痛,具有缓解炎症的作用。但是,特异性PDE2A抑制剂Bay 60-7550是否能够减轻腰椎间盘突出症所引起的神经根炎,从而缓解神经根炎大鼠的根性疼痛,目前还缺乏相关报道。近些年,医用臭氧疗法(oxygen/ozonetherapy)在临床中广泛使用,如疼痛性疾病、肿瘤辅助治疗、妇科疾病、病毒性肝炎、溃疡性结肠炎、口腔科疾病等。医用臭氧疗法在疼痛科也被逐渐认可,在腰椎间盘突出症、神经根炎、骨性关节炎及软组织炎症等疼痛性疾病的治疗中取得了较好的临床疗效。临床研究发现医用臭氧疗法治疗腰椎间盘突出症所引起的神经根炎,临床疗效好且不良反应少。实验研究也证实低浓度臭氧椎管内注射能够减轻腰椎间盘突出症伴随的神经根炎。臭氧(ozone,03)是一种极不稳定,易溶解于水的气体,具有较强的氧化能力。目前,关于臭氧疗法的机制研究发现臭氧可以使髓核脱水,减小髓核体积,缓解椎间盘压迫;刺激抗炎因子IL-10和成纤维生长因子-β1(TGF-β1)的释放,抑制凋亡蛋白和IL-1β的过度表达,改善局部氧供,从而减轻炎性反应。但关于低浓度臭氧治疗神经根炎的内在机制,相关研究仍较少。研究发现cAMP/cGMP、NF-κB等均是PDEs的下游信号通路,在炎症和疼痛传导中也发挥着重要作用。cAMP/cGMP能够激活蛋白激酶A(PKA)/蛋白激酶G(PKG),激活一氧化氮合酶(NOS),促进轴突生长,改善脊髓损伤和外周神经病变,在神经突触传递中起关键作用。NF-κB/p65是一种核转录因子,具有诱导TNF-α趋化因子等多种促炎因子的作用,参与炎症反应。实验研究发现抑制NF-κB/p65能够减少TNF-α、IL-1β和IL-6等因子的释放,达到减轻炎症的作用。但PDE2A-cAMP/cGMP-NF-κB/p65信号通路是否参与低浓度臭氧的抗炎作用目前尚无相关报道。本课题组前期关于臭氧对大鼠脊髓神经毒性的研究证实,低浓度医用臭氧对脊髓无明显毒性,而高浓度臭氧通过内质网钙释放和CaMKII/MAPK信号通路产生明显的脊髓神经毒性。因此本研究采用低浓度臭氧鞘内给药的方式探讨低浓度臭氧治疗慢性神经根炎的可能机制,为将来更安全有效地使用医用臭氧疗法提供理论依据。研究目的第一部分建立非压迫性腰椎间盘突出症(NCLDH)大鼠神经根炎模型,研究PDE2A抑制剂Bay 60-7550是否对慢性神经根炎有治疗作用,并探讨PDE2A-cAMP/cGMP通路是否参与PDE2A抑制剂的抗炎作用。第二部分通过建立NCLDH大鼠神经根炎模型,探讨低浓度臭氧鞘内给药是否能够治疗NCLDH大鼠神经根炎,及PDE2A-cAMP/cGMP-NF-κB/p65信号通路在其中的作用,为医用臭氧疗法的临床应用提供理论依据。方法第一部分:1.分组将32只Wistar大鼠随机分为四组:假手术组(sham组,n=8,假手术+鞘内注射10μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)),对照组(vehicle组,n=8,NCLDH模型+鞘内注射10μl DMSO),Bay0.1 组(n=8,NCLDH 模型+鞘内注射 Bay60-75500.1mg/kg),Bay 1.0 组(n=8,NCLDH 模型+鞘内注射 Bay 60-7550 1.0mg/kg)。2.建立大鼠NCLDH模型及鞘内置管建立NCLDH大鼠模型:将大鼠麻醉后,暴露L5/6右侧椎间孔,切除L5右侧椎板。显露右侧L5神经根和背根神经节(DRG),将收集到的尾椎髓核轻轻放置在暴露的L5DRG表面,避免机械性压迫。鞘内置管:经暴露的右侧L5椎间孔,将PE-10聚乙烯导管向头端方向置入约0.5cm,见脑脊液流出,即到达蛛网膜下腔。固定导管,避免挤压和损伤L5右侧DRG,逐层缝合肌肉筋膜和皮肤。待大鼠清醒后,经导管裸露端注入2%利多卡因10μl,若大鼠双侧后肢出现拖拽或无力现象,确认鞘内置管位置正确。假手术组仅切除右侧L5椎板并行鞘内置管,而不放置髓核。手术后第1天,完成机械性缩足阈值检测后,Bay0.1组、Bay1.0组大鼠分别鞘内注射10μl Bay 60-7550 0.1mg/kg和1.0mg/kg;假手术组和对照组分别鞘内注射 10μl 1%DMSO。3.检测Bay 60-7550对NCLDH大鼠机械痛阈以及脊髓中TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP、cGMP和PDE2A的影响在术前和NCLDH模型建立后1-7天,每天上午10:00测定大鼠同侧后足机械性缩足阈值(PWT)。术后第7天,处死大鼠取出同侧腰4-6节段脊髓背角,用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP和cGMP,用Real-Time PCR和Western blot检测PDE2A的mRNA和蛋白水平。第二部分:1.分组将40只Wistar大鼠随机分为五组:假手术组(sham组,n=8,假手术+鞘内注射20μ1过滤空气),对照组(control组,n=8,NCLDH模型+鞘内注射20μl过滤空气),臭氧 10μg/ml 组(03 1Oμg/ml组,n=8,NCLDH 模型+鞘内注射 1Oμg/ml 臭氧 20μl),臭氧 20μg/ml 组(O3 20μg/ml 组,n=8,NCLDH 模型+鞘内注射 20μg/ml 臭氧 20μl),臭氧30μg/ml组(O3 30μg/ml组,n=8,NCLDH模型+鞘内注射30μg/ml臭氧20μl)。2.建立大鼠NCLDH及鞘内置管模型具体方法同第一部分。术后第一天,完成行为学检测后,10、20、3μg/ml臭氧组分别使用无菌微量注射器鞘内单次注射10、20、30μg/ml臭氧20μl,假手术组和对照组分别给予过滤空气20μl。3.检测10、20、30μg/ml臭氧对NCLDH大鼠机械痛阈的影响及脊髓中TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP、cGMP、PDE2A和NF-κB/p65 的水平在术前和模型建立后1-7天,每日同一时间测定大鼠机械性缩足阈值。术后第7天,处死大鼠取出同侧L4-6节段脊髓背角,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP和cGMP,用 Real-Time PCR和Western blot检测PDE2A和NF-κB/p65 的mRNA和蛋白水平。结果第一部分:1.成功建立NCDLH大鼠模型,大鼠同侧后足机械性缩足阈值明显下降(P<0.05),脊髓背角中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.05),脊髓背角PDE2A的mRNA及蛋白表达明显增多(P<0.05),cAMP和cGMP浓度明显升高(P<0.05)。2.术后1-7天,与对照组相比,鞘内注射Bay 60-7550可显著升高NCLDH大鼠后足机械性缩足阈值(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。术后第7天,与对照组相比,Bay 0.1组和Bay 1.0组TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。与对照组相比,Bay 0.1组和Bay 1.0组cAMP和cGMP水平均显著升高(P<0.05),呈剂量依赖性(P<0.05),其中以cGMP升高更为明显。3.与对照组相比,Bay 60-7550 1.0mg/kg显著降低PDE2A的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。第二部分:1.成功建立NCLDH大鼠模型。2.术后1-7天,与对照组相比,鞘内注射10、20、30μg/ml臭氧可显著提高模型大鼠同侧后足降低的机械性痛阈(P<0.05);术后第7天,与对照组相比,10、20、30μg/ml臭氧显著降低过度表达的TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05);显著升高cAMP和cGMP水平(P<0.05)。与10、30μg/ml臭氧组相比,这些结果在20μg/ml臭氧组最为显著。3.20μg/ml臭氧可降低脊髓中过度表达的PDE2A和NF-κB/p65的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。结论第一部分:1.成功建立NCLDH大鼠慢性神经根炎模型,脊髓背角中PDE2A可能参与神经根炎的形成。2.PDE2A抑制剂Bay 60-7550可通过调节cAMP/cGMP信号通路,缓解NCLDH大鼠的神经根炎和机械性痛觉过敏。为神经根炎的治疗提供一种新的思路。第二部分:1.成功建立大鼠慢性神经根炎模型。2.低浓度臭氧鞘内注射可减轻NCLDH大鼠神经根炎,缓解机械性痛觉过敏。其作用机制可能与PDE2A-cAMP/cGMP-NF-κB/p65信号通路有关,为低浓度医用臭氧疗法治疗神经根炎提供理论依据。3.且在10、20、30μg/ml三个浓度中,20μg/ml臭氧其抗炎效果最强,为低浓度臭氧疗法治疗神经根炎提供浓度参考。