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目的:杜兴肌肉萎缩症是一种致死性的伴X染色体遗传的神经肌肉疾病,是由dystrophin基因突变导致dystrophin蛋白缺失而引起,目前在临床上还没有有效的治疗方法。尽管不同的基因治疗方法取得不同程度的进展,但都存在一定的局限性。其中,反义寡核苷酸干预前体RNA拼接过程的疗法被认为是最有应用前景的疗法之一。目前已有两种不同结构的反义寡核苷酸药物进入临床试验,但二者都存在系统运输效率低、用药量大以及在心脏中作用效果有限的问题。因此,亟需研发新型运输辅助剂来提高反义寡核苷酸药物的系统运输效率,从而增强药效及减少用药量。5%葡萄糖已在临床上被长期广泛使用,本课题组在研究中,发现葡萄糖及其他碳水化合物均能提高反义寡核苷酸PMO的活性。基于这一发现,本课题对碳水化合物对反义寡核苷酸药物活性的影响展开系统研究,并深入地阐释碳水化合物的作用机理。方法:1.碳水化合物与PMO在mdx小鼠上的局部和系统测试:首先将不同碳水化合物分别与PMO混合,在杜兴肌肉萎缩症疾病模型-mdx小鼠上,经局部和系统测试,利用IHC、RT-PCR及Western blot方法,以确定最佳候选辅助剂;通过在mdx小鼠上系统测试glucose/fructose(GF)与低于系统有效剂量的PMO的作用效果,以确定GF对是否能降低PMO系统有效剂量;按50mg/kg剂量,对PMO-GF在mdx小鼠上进行长期系统测试,分别从dystrophin蛋白表达水平、mdx小鼠肌肉的病理状态及肌肉功能恢复和安全性等方面进行系统评估。2.对GF作用机理的阐释:为确定GF是否通过增强PMO跳读频率或细胞摄取而起作用,将PMO和GF分别注射于mdx小鼠同一个前胫骨肌,时间间隔16h;另外,将GF与Lissamine标记的PMO在mdx小鼠上进行系统注射,利用小动物活体成像系统检测不同组织中荧光强度,以确定GF的作用方式;通过利用GF不同光学异构体、不同浓度GF以及葡萄糖转运受体抑制剂phloretin,以确定GF跨膜运输对其功能性的影响;同样,使用GF类似物2-DG和敲减PFK表达水平等方法,以确认GF代谢对其功能性的影响;利用ATP合成酶抑制剂oligomycin A、ATP注射和系统尾静脉注射GF并局部注射PMO等试验,以确认能量与GF功能性的关系;并利用细胞模型,对PMO在细胞上的摄取途径及GF作用机理进行了确认;在C57BL6和SOD1G93A两种小鼠模型对GF展开系统测试,以确定GF是否适用于其他能量缺乏小鼠模型。3.GF对其他核酸类药物的作用效果:分别将GF与肽修饰PMO、2’OMe和GAPDH si RNA在mdx小鼠上进行系统测试,利用IHC、RT-PCR、Western blot和小动物活体成像等方法确认GF对其他核酸类药物的作用效果。结果:1.碳水化合物与PMO在mdx小鼠上的局部和系统测试结果。对PMO与不同碳水化合物在mdx小鼠上局部和系统筛选结果:发现GF对PMO活性增强效果最佳。GF与50mg/kg PMO在mdx小鼠上的短期和长期系统测试结果,发现GF能够显著降低PMO系统有效剂量;长期使用GF能够显著提高PMO活性和dystrophin蛋白表达水平,改善mdx小鼠肌肉病理状态和肌肉功能,且未检测到任何毒副作用。2.对GF作用机理的阐释结果。PMO跳读频率和体内分布试验结果表明:GF增加PMO在mdx小鼠肌肉中的细胞摄取率,而对PMO跳读频率无影响。L型GF和葡糖糖转运受体抑制剂phloretin显著降低PMO活性;而GF浓度超过5%后,其增强PMO活性和dystophin蛋白表达水平达到饱和,表明跨膜运输影响GF功能性。GF类似物2-DG不能提高PMO的活性;敲低GF代谢过程中关键酶PFK表达,GF功效显著减弱,表明GF分解代谢影响其功能性。ATP合成酶抑制剂oligomycin A能够显著抑制GF的功能性;同时,GF和ATP共注射,对PMO活性无明显的协同效应,说明GF是通过代谢产能而产生功效;尾静脉系统注射高剂量GF,可显著提高局部注射PMO的活性;PMO-GF长期治疗的mdx小鼠肌肉中能量状态得到明显改善,这些结果说明GF是通过代谢产能,进而改善细胞中能量状态而发挥功效。在细胞模型上进一步确认,PMO是通过受体介导的内吞作用方式进入细胞,GF代谢产能可提高PMO的细胞摄取;在其他模型上的系统测试结果表明:GF适用于其他能量缺乏的疾病模型。3.GF与其他核酸类药物在mdx小鼠系统测试结果显示:GF可显著提高2’OMe、si RNA和R-PMO在骨骼肌中的摄取和活性。结论:1.本研究首次证明碳水化合物可作为核酸类药物的运输辅助剂。2.通过对不同碳水化合物局部及系统筛选测试,确定GF对PMO作用效果最佳,并能显著降低PMO系统有效剂量。3.通过在mdx小鼠上对PMO-GF长期系统测试,证明GF是一种安全、高效的运输辅助剂,且长期使用作用效果更为显著。4.通过系统的体内和体外机理试验,证明GF是通过分解代谢产能,改善mdx小鼠肌肉中的能量状态,从而提高肌肉中PMO摄取率和活性。5.通过在mdx小鼠上对其他三类不同寡核苷酸药物的测试,证明GF可适用于其他类寡核苷酸药物,具有普适性。6.通过对GF在不同疾病模型上的系统测试,证明GF可促进反义寡核苷酸药物在其他能量缺乏疾病模型的系统摄取和活性,可适用于其他能量缺陷型疾病模型。