益生菌是人体肠道内正常的生理性有益菌,是肠粘膜生物屏障的主要组成部分,进入肠道内的益生菌通过粘附定植于肠粘膜表面以保护肠粘膜上皮细胞免受各种病原微生物的损伤,所以益生菌在肠道内的粘附定植是其发挥生理作用的前提和基础,但是,目前对于益生菌粘附性能的检测还没有一个合适的实验方法;而且,益生菌的粘附性能具有菌株特异性,高粘附性能的模式菌株较少,有关粘附的生物学保护作用和粘附机制等研究尚缺乏系统性资料。因此,本研究通过优化体外粘附实验方法,对11株益生菌的粘附性能进行检测,筛选得到粘附性能较好的乳杆菌,以该菌株作为研究材料,对其粘附的生物学保护作用进行研究,并对其参与粘附的粘附素分子进行初步的提取和鉴定。方法:(1)以体外培养的肠上皮样细胞HT-29为模型,对影响益生菌体外粘附细胞的外部因素进行了探讨,通过优化的体外细胞粘附实验方法,对11株益生菌的粘附性能进行检测,并与放射性同位素标记法和粘蛋白的ELISA法进行比较。通过制备粘附性能较好菌株的多克隆抗体,采用改进的Carnoy固定液对肠粘膜组织标记进行固定,然后制备冰冻切片并进行免疫组化分析,建立乳杆菌体内粘附定植模型。(2)比较不同粘附性能的菌株对体外培养的HT-29细胞的保护作用。建立抗生素脱污染EPEC感染的小鼠模型,通过肠粘膜病理切片、肠道菌群分析以及细菌移位分析等,观察乳杆菌对肠粘膜屏障的保护作用。(3)对筛选得到的高低粘附力菌株的细菌表面成分和培养乏液进行酶、热、过碘酸钠等处理,以观察细菌表面成分和培养乏液对粘附的影响;采用溶菌酶、变溶菌素以及硫酸铵等对细菌胞壁表面蛋白和培养乏液中的蛋白进行提取,通过与HRP标记的粘蛋白受体和NHS-Biotin标记的HT-29进行杂交,对参与粘附的细菌胞壁表面蛋白和促粘附因子进行初步鉴定;通过制备细菌的多克隆抗体,筛选与HT-29细胞粘附的胞壁靶蛋白;并将粘附相关蛋白进行质谱分析。结果:(1)优化了体外粘附评价实验方法。pH值、孵育时间、菌液浓度以及菌的生长状态均可影响乳杆菌与HT-29细胞的粘附。优化其基本步骤为:采用培养14天后的肠上皮样细胞HT-29,与培养至稳定期的菌液浓度为1～2×10~8/ml益生菌(含益生菌的SCS),在37℃下共孵育60min,然后用灭菌的PBS洗涤细胞5次,甲醇固定20min,革兰氏染色,镜检计数。11株益生菌的粘附性能检测结果表明,乳杆菌属和双歧杆菌属的各种间不同菌株在体外对HT-29细胞的粘附能力相差很大,其中罗伊氏乳杆菌JCM1081的粘附指数为495.07±80.03,显著高于其它益生菌株;嗜酸乳杆菌La1.1878和长双歧杆菌B050102-14的粘附能力较弱,其粘附指数分别为135.43±13.93和47.17±5.84;制备了罗伊氏乳杆菌JCM1081的多克隆抗体,免疫组化分析表明,在小鼠肠组织中可见罗伊氏乳杆菌JCM1081在肠粘膜表面呈弥散状分布、定植,形成肠粘膜菌群生物屏障;(2)粘附性能较好的罗伊氏乳杆菌JCM1081在体外可抑制致病性大肠杆菌对肠上皮样细胞HT-29的粘附(28.1%)(P＜0.01)和侵袭(23.9%)(P＜0.01),粘附力较弱的嗜酸乳杆菌La1.1878对致病性大肠杆菌的粘附抑制率为12.4%(P＜0.01),侵袭抑制率为7.5%(P＜0.01)。抑菌实验结果显示,嗜酸乳杆菌La1.1878对EPEC的抑制作用显著高于罗伊氏乳杆菌JCM1081(P＜0.01)。乳杆菌粘附肠上皮样细胞HT-29后,细胞结构正常,乳酸脱氢酶释放量和细胞活力无明显变化。不显著影响单层细胞的通透性和细胞微丝骨架F-actin。乳杆菌减弱了致病性大肠杆菌对肠上皮细胞样HT-29的损伤(P＜0.05)。小鼠体内实验结果表明,灌胃乳杆菌的治疗组肠道菌群中双歧杆菌和乳杆菌的数量与致病性大肠杆菌感染的模型组相比,有显著增加(P＜0.05);在肝、脾、肾等实质器官以及肠系膜淋巴结处发现有部分肠杆菌,但数量明显低于EPEC感染模型组(P＜0.01)。(3)罗伊氏乳杆菌JCM1081菌体经胰蛋白酶、蛋白酶K处理后,其对HT-29细胞的粘附力显著下降(P＜0.01);提取了罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白,Westernblot结果显示29kD和14kD的两种蛋白与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性;多抗鉴定结果显示,29kD的蛋白与罗伊氏乳杆菌JCM1081的多克隆抗体产生杂交阳性条带;将29kD的蛋白进行质谱分析后,结果表明,此蛋白与罗伊氏乳杆菌ATCC55730的lr0793蛋白的相似性高达71.1%,实际分子量为28519.54Da,有263个氨基酸,PI为9.78,属于ATP-Binding Cassette蛋白家族。采用相同的方法对其它8株乳杆菌的胞壁表面蛋白进行了鉴定,结果显示,其中,只有鼠李糖乳杆菌1.120存在29kD的杂交阳性条带,而嗜酸乳杆菌L050103-12存在43kD、63kD以及85kD的三种蛋白杂交阳性,在其它乳杆菌中未检测出杂交阳性条带。将罗伊氏乳杆菌JCM1081的培养乏液用PBS、新鲜的MRS替换,或经过胰蛋白酶或蛋白酶K处理,乳杆菌JCM1081对HT-29的粘附力显著下降(P＜0.01);罗伊氏乳杆菌JCM1081的SCS不能促进低粘附力菌株嗜酸乳杆菌La1.1878对HT-29细胞的粘附;对JCM1081的SCS进行了蛋白提取,经初步提纯,SDS-PGAE和Western blol结果表明,在其SCS中存在一种29kD的小分子蛋白,与HRP标记的粘蛋白受体杂交可产生阳性。结论:1.细胞培养革兰氏染色法是一种有效的检测益生菌粘附性能的实验方法,它与放射性同位素法、荧光标记法以及活菌计数法相比较,具有操作简单,重复性好,实验结果稳定可靠等优点。2.乳杆菌属和双歧杆菌属的各种间不同菌株粘附能力相差很大,筛选了高粘附力菌株罗伊氏乳杆菌JCM1081,为研究乳杆菌的粘附保护作用及粘附机制提供了良好模式材料,同时也提供了一株高粘附性能的益生菌株。3.高粘附力菌株罗伊氏乳杆菌JCM1081对HT-29细胞具有粘附保护作用,其粘附性能的高低与生物保护作用的强弱具有一定相关性。乳杆菌JCM1081可抑制致病性大肠杆菌对肠上皮样细胞HT-29的粘附和侵袭,减弱了致病性大肠杆菌对肠上皮细胞样HT-29的损伤;罗伊氏乳杆菌JCM1081可粘附定植于肠粘膜,形成生物屏障,维持并保护肠粘膜的正常功能。4.JCM1081的粘附能力与其细胞壁表面的蛋白成分密切相关。分离纯化鉴定了其中的一种重要的参与其粘附的新蛋白成分,该蛋白分子量为29kDa,是其主要的粘附素分子之一;29kD蛋白与罗伊氏乳杆菌ATCC55730的lr0793蛋白相似性高达71.1%,有263个氨基酸,PI为9.78,属于ATP-Binding Cassette蛋白家族。其培养乏液中存在有29kD的促粘附因子,与胞壁表面29kD的粘附素蛋白可能为同一类物质。该结果提示29kD蛋白为一种分泌性蛋白,一部分分布于细胞壁表面,用于识别细胞膜表面的粘附素受体,另一部分则分泌至胞外培养乏液中,介导了菌体与细胞的粘附。29kD的粘附素蛋白在乳杆菌中并不是普遍存在的,不同种属的乳杆菌,其参与粘附的蛋白种类亦存在多样性。