论文部分内容阅读
为了表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）中抗原性较强的两段蛋白片段—gp52C末端和pp150C末端的嵌合肽，用基因工程技术构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）以此表达目的蛋白，并对表达蛋白进行鉴定。根据人巨细胞病毒糖蛋白gp52和磷酸蛋白pp150C末端的cDNA序列，设计出2对引物。利用重组PCR的方法，以病毒培养液上清为模板，把二个目的基因串联在一起。所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4DNA连接酶与pPIC9K载体进行连接，然后导入大肠杆菌DH5α，用PCR法筛选阳性转化子，并用双酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。重组质粒线性化后，用电击法将重组质粒转化入巴氏毕赤酵母，在缺组氨酸的MD板上筛选阳性菌落，然后用不同浓度的G418—YPD板筛选多拷贝插入单菌落。培养多拷贝插入的酵母细胞，用甲醇诱导目的蛋白的分泌，SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。 重组PCR扩增出两端带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的目的基因片段。目的基因经双酶切后连接载体pPIC9K，然后导入大肠杆菌DH5α中，在含氨卞青霉素（AMP）的LB板上用PCR反应筛选出阳性菌落，双酶切结果表明目的基因已插入载体中，且方向正确，测序结果进一步证明人巨细胞病毒重组基因表达质粒成功地克隆了目的基因片段。重组质粒转化巴氏毕赤酵母，G418筛选出多拷贝插入的单克隆，甲醇诱导多拷贝插入的单克隆酵母细胞分泌目的蛋白，培养液上清经SDS-PAGE电泳分析，在蛋白质印迹中检测到培养液上清有一表观分子量为36KD，能与羊抗HCMV多克隆抗体发生发应的条带。实验结果表明重组人巨细胞病毒嵌合肽成功地在巴斯德毕赤酵母中获得表达。