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猪链球菌（Streptococcus suis,SS）根据其荚膜抗原成分的不同分为33个血清型，其中2型猪链球菌的临床分离率最高。该型猪链球菌除了能引起猪致病外，还是一种重要的人畜共患病病原，不仅制约着养猪业的健康发展，而且还威胁着人类的身体健康。 猪链球菌病（Swine streptococcosis）的防治主要通过疫苗接种与抗生素的使用，但长期使用抗生素不仅会导致耐药菌株的出现，而且还会引起药物残留及食品安全等方面的问题。同时对于动物传染病来讲，预防比治疗更为有效，也更加经济。而商品化的灭活疫苗存在生产成本高、副作用大等缺陷，因此针对影响与危害最大的2型猪链球菌开展新型、安全、有效的疫苗研究成为当务之急。 鉴于此，本研究在2型猪链球菌ΔEce1单基因缺失突变体的基础上，构建了ΔEce1/ΔSalK/R双基因缺失突变株，并对其生物学特性、安全性、免疫原性和免疫保护力效果进行了研究，主要研究内容有： 1.双基因缺失突变株的构建 设计引物从2型链球菌野生菌SC19基因组中扩增获得SalK/R基因的上游同源臂SalK-up和下游同源臂SalK-down，插入自杀性质粒pSET4s上获得重组转移质粒pSET4s-SalK/R，将其电转化2型猪链球菌ΔEce1感受态细胞，经过抗性筛选和PCR鉴定，获得2型猪链球菌ΔEce1/SalK/R双基因缺失株。 2.双基因缺失突变株的生物学特性研究 生物学特性分析证实双基因缺失突变株ΔEce1/ΔSalK/R与野生菌株 SC19和单基因缺失突变株ΔEce1在TSA固体培养基上形成的菌落形态和大小均无显著差异，生长曲线相似，但两株缺失菌株比野生菌株SC19生长要快；3个菌株的生化特性没有差异，双基因缺失突变株对Hep2细胞的粘附能力和毒性都显著低于野生菌株SC19，在TSB培养基中能稳定传代。 3.双基因缺失突变株对CD-1小鼠的致病力 将不同剂量（5×106-5×1012 CFU）的双基因缺失突变株和野生菌株SC19经腹腔注射CD-1小鼠，结果5×106-5×1010CFU双基因缺失突变株接种的小鼠及5×106CFU野生菌接种的小鼠均未表现出任何不良反应，但接种高剂量（5×1011和5×1012CFU）双基因缺失突变株的部分小鼠和接种野生菌株SC19的其它剂量的所有小鼠均表现出典型的2型猪链球菌病症状，并有不同数量的小鼠死亡。根据小鼠的死亡情况来计算双基因缺失突变株和野生强毒菌株SC19对CD-1小鼠的LD50分别为1.24×1012CFU和3.04×107CFU。 4.双基因缺失突变株株对猪的安全性 将双基因缺失突变株以5×109、5×108和5×107CFU3个剂量分别经颈部肌肉接种仔猪，同时以1.5×106CFU野生菌SC19接种仔猪作对照，结果双基因缺失突变株接种组未表现出任何不良反应，而野生菌对照组表现出严重的猪链球菌病症状，并于一周内全部发病死亡，说明3个不同剂量的双基因缺失突变株对猪是安全的。 5.双基因缺失突变株对猪的免疫剂量的确定 将双基因缺失突变株以5×108、108、5×107和107CFU4个剂量分别经肌肉接种仔猪，同时设置对照组。于免疫后第14天和21天采血检测CPS抗体，结果5×108、108和5×107CFU剂量组都产生了高水平的抗体（>0.36）；107CFU剂量组产生的抗体水平略低（<0.31）。免疫后第22天经静脉接种1.5×106CFU的2型猪链球菌野生菌株SC19，5×108和108CFU剂量组的所有猪均未表现出任何不良反应；5×107CFU和107CFU剂量组分别有1头和3头猪表现出典型的猪链球菌病症状，其中107CFU组有2头猪死亡。根据实验结果确定双基因缺失突变株对猪的免疫剂量为108CFU。 6.双基因缺失突变株对猪的保护力研究 将双基因缺失突变株以108CFU的剂量经肌肉接种仔猪，同时设置对照组。免疫后第14天和21天采血检测CPS抗体，结果免疫组都产生了高水平的特异性抗体。免疫后第22天分别经静脉接种1.5×106CFU的2型猪链球菌SC19株和3×109CFU的9型猪链球菌SS-9株，结果两种血清型猪链球菌攻毒的免疫组未表现出任何不良反应，也未表现出任何眼观病理变化和显微病理变化；而非免疫组在攻毒后都表现出典型的猪链球菌病症状，并于一周内全部发病死亡，并且所有猪都表现出明显的猪链球菌病眼观病理变化和显微病理变化特征，说明108CFU的双基因缺失突变株能够保护免疫猪抵抗致死剂量的2型和9型猪链球菌强毒菌株的攻击。 7.双基因缺失突变株与商品化疫苗的对比试验 将双基因缺失突变株以108CFU的剂量经肌肉接种仔猪，同时以商品化的两种灭活疫苗A和B作为对照，并设置空白对照组。免疫后第14天和21天分别采血检测CPS抗体，结果双基因缺失疫苗免疫组的抗体水平比商品化疫苗A和B免疫组都高。免疫后第22天经静脉接种1.5×106CFU的2型猪链球菌野生菌株SC19，双基因缺失疫苗免疫组未表现出任何不良反应；商品化疫苗A免疫组有40%的猪发病，未见死亡，而商品化疫苗B免疫组有80%的猪发病，有40%的猪死亡。病理剖检和组织病理学分析结果显示双基因缺失疫苗免疫组未表现出任何病理变化，而两种商品化疫苗免疫组均呈现一定程度的眼观病理变化和显微病理变化，说明双基因缺失突变株免疫保护效果优于两种商品化的灭活疫苗。