脑脓肿(brain abscess,BA)是一种严重的致死性中枢神经系统感染性疾病,可由多种细菌感染引起。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)是一种重要的病原菌,其在脑脓肿患者标本中的分离培养率高居第二位。金葡菌是定植于人体的常见机会致病菌,其定植可显著增加宿主发生侵袭性感染的风险。金葡菌导致疾病主要通过表达和释放多种毒力因子来实现。金葡菌能产生多达50种的毒力因子,大致分为毒素、黏附素和免疫逃逸因子三大类。金葡菌在引起不同类型感染的过程中,表达的毒力因子也不同。迄今,金葡菌导致脑脓肿形成的关键毒力因子尚未见报道,筛选和鉴定相关毒力因子不仅对阐明金葡菌致脑脓肿形成的具体机制有重要意义,也对提出有效的脑脓肿防治措施具有重要的现实意义。金葡菌可通过大脑毗邻部位(如耳、鼻腔)直接蔓延,或者通过系统性感染的血源播散,破坏并穿过血脑屏障进入颅内,引起致命的中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染,如脑膜炎、脑脓肿等。本研究首先构建了金葡菌小鼠耳定植、菌血症和脑脓肿模型,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测,筛选出金葡菌致脑脓肿的候选毒力基因;进一步构建相应毒力基因的敲除株,鉴定出金葡菌致脑脓肿的关键毒力因子,并用特异性抗体阻断实验进行验证。主要研究内容和结果如下:1.金葡菌耳定植、菌血症及脑脓肿小鼠模型的构建分别以金葡菌Newman株和XQ株为实验菌株构建耳定植、菌血症及脑脓肿小鼠模型,验证正确。2.RT-qPCR筛选金葡菌致脑脓肿的候选关键毒力因子2.1金葡菌耳定植、菌血症及脑脓肿标本总RNA提取、反转录及质量控制分别收集模型动物的耳拭子、血液和脑组织样本,提取金葡菌与宿主细胞混合样本的总RNA,反转录成cDNA。以质控DNA,排除cDNA样本中的PCR扩增抑制因素。2.2金葡菌致脑脓肿候选关键毒力因子的SYBR~?Green RT-qPCR初筛采用SYBR~?Green RT-qPCR方法,以16S rRNA基因为内参,分别比较Newnan株和XQ株中42个毒力基因在脑脓肿模型中与在体外培养基、耳定植和菌血症状态中的表达水平差异。结果显示,金葡菌毒力因子在体内(脑脓肿)的表达水平与体外(TSB或RPMI培养)比较差异明显。与耳定植状态相比,金葡菌在脑脓肿中绝大部分基因表达上调(Newnan株的clfA和essA,XQ株的icaD除外)。与菌血症状态相比,脑脓肿中金葡菌的9个基因(isdA,isdB,isdC,sasF,sdrC,hla,pvlF,aur和spa)在至少一个菌株中表达上调。2.3金葡菌致脑脓肿候选关键毒力因子的TaqMan~?RT-qPCR复筛利用TaqMan~?探针的高特异性,进一步选择23个毒力基因(包括脑脓肿相对菌血症发生上调的9个基因,以及脑脓肿相对耳定植比较时,至少在一个菌株中表达显著上调的14个基因),采用TaqMan~?RT-qPCR进行复筛,比较这些毒力因子在脑脓肿、耳定植及菌血症中的表达差异。结果发现,脑脓肿与耳定植状态相比,有5个毒力基因(isdB,sasF,hla,pvlF和spa)在两株金葡菌中均显著上调。其余18个基因,除adsA外,均至少在一个菌株中显著上调。脑脓肿与菌血症状态相比,13个基因表达上调。其中,6个毒力基因(isdA,isdB,isdC,sasF,sdrC和adsA)至少在一个菌株中显著上调。以上结果提示这些毒力因子可能在金葡菌致脑脓肿形成过程中发挥关键作用。通过以上SYBR~?Green和TaqMan~?RT-qPCR递进筛选,得到了11个金葡菌致脑脓肿形成的候选关键毒力因子,包括:(1)脑脓肿与耳定植相比,在两个菌株中都显著上调的5个基因(isdB,sasF,hla,pvlF和spa)及在XQ株中显著上调的lgt基因;(2)脑脓肿与菌血症相比,在两个菌株中持续上调的3个基因(isdA,isdC和aur)及在Newman株中表达上调的2个基因(sdrC和adsA)。3.金葡菌致脑脓肿关键毒力因子的鉴定本部分主要通过基因敲除、抗体阻断等手段对候选的11个毒力因子进行鉴定。3.1单、双基因敲除菌株的构建及鉴定以Newman株为研究对象,采用同源重组方法,进行目的基因的无痕敲除。最终成功构建了8个(isdA,isdC,lgt,hla,spa,sdrC,aur和sasF)单基因敲除株,另有3个基因(isdB,pvlF和adsA)未能成功敲除。在此基础上,又构建了Newman-Δhla/Δspa,Newman-ΔsdrC/Δaur和Newman-ΔsdrC/ΔsasF双基因敲除株。所有敲除株均采用PCR扩增和DNA测序鉴定。3.2候选毒力因子敲除株或抗体阻断对金葡菌致脑脓肿形成能力的影响以构建的8个单基因及3个双基因敲除株为基础,分别将敲除株与野生株感染小鼠,观察不同菌株致脑脓肿形成能力的差异。结果显示,与野生株相比,Newman-ΔisdA,-ΔisdC,-Δlgt,-Δhla,-Δspa单敲株和Newman-Δhla/Δspa双敲株所致脑脓肿的细菌载量及脓肿体积均显著下降,而其余突变菌株的感染结果则与野生株无明显差异,表明isdA,isdC,lgt,hla和spa等5个基因在金葡菌致脑脓肿中发挥关键作用。为进一步验证spa和hla在金葡菌致脑脓肿中的作用,联合应用SpA和Hla单克隆抗体进行抗体阻断实验。结果显示,抗体阻断组中小鼠脑脓肿的细菌载量和脓肿体积均较PBS对照组显著下降,病理切片及全脑三维重建显示,抗体阻断对金葡菌致脑脓肿形成具有明显的抑制作用,表明Spa和Hla是金葡菌致脑脓肿形成的关键毒力因子。3.3候选毒力因子对金葡菌耳定植及菌血症的影响为探讨筛选到的毒力因子在金葡菌致脑脓肿形成中的作用特异性,将Newman野生株,5个金葡菌致脑脓肿关键毒力因子的单基因敲除株(Newman-ΔisdA,-ΔisdC,-Δlgt,-Δhla,-Δspa)及1个双基因敲除株(Newman-Δhla/Δspa)分别制作小鼠耳定植及菌血症模型,比较细菌载量。结果显示,5个单敲株及1个双敲株在小鼠耳定植中的细菌载量与野生株无明显差异;在菌血症模型中,仅有lgt单基因敲株在感染后1hr血液样本中的细菌载量较野生株升高,其余菌株均无明显差异,表明前期筛选到的5个关键毒力因子在金葡菌致脑脓肿中发挥关键作用,而对金葡菌耳定植及早期菌血症感染的影响不大。综上所述,本研究首先构建了金葡菌耳定植、菌血症以及脑脓肿的小鼠感染模型,采用SYBR~?Green和TaqMan~?RT-qPCR法筛选出11个可能在金葡菌致脑脓肿形成中发挥重要作用的候选毒力因子,再通过构建基因敲除株鉴定出isdA,isdC,lgt,hla和spa等5种金葡菌致脑脓肿的关键毒力一致,并用特异性抗体阻断实验加以验证。这些结果不仅有助于进一步理解金葡菌致脑脓肿形成的具体机制,同时可为金葡菌脑脓肿感染的防治策略提供潜在靶标。