蜜蜂抗菌肽Apidaecins(AP)是一种阳离子多肽,含有18个氨基酸残基,能抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长,对动物细胞安全,具有重要的应用价值。目前生产抗菌肽最有效的手段是利用基因工程技术进行异源表达。本研究尝试设计多种不同的融合蛋白携带蜜蜂抗菌肽在不同的表达系统中进行表达,对其表达的融合蛋白进行抑菌活性检测,对比分析每种表达方式的优缺点,并从中选取一种适合蜜蜂抗菌肽(AP)的表达方式。融合表达抗菌肽技术,可以提高抗菌肽的分泌量和稳定性,减少被降解的几率,然而融合标签的切割难题严重限制了该方法在实际生产中的应用。目前切割融合标签的方法有酶法和溴化氢法,这两种方法或者成本高,或者有剧毒,而且影响抗菌肽的活性。本研究尝试了自切割的内含肽、类泛素蛋白SUMO和Asp-Pro二肽三种易于切割的融合表达方式。1)自切割的内含肽作为融合标签,只要提供一定的pH,便能自我切割,释放C端目的蛋白,且不影响目的蛋白的结构;2)SUMO不但能够稳定抗菌肽AP的表达,使之不易被降解,而且具有专一的蛋白酶,融合蛋白经切割后,抗菌肽序列不会有任何的氨基酸残留;3)Asp-Pro二肽是一种酸敏感位点,诱导表达的融合蛋白经强酸调节pH之后,Asp-Pro二肽发生断裂,释放抗菌肽,此方法的成本极低。抗菌肽的抑菌活性检测较为复杂,为了简化活性检测方法步骤,本研究特地选用了易于检测且能高表达的基因用作融合标签,表达抗菌肽AP。如能够在毕赤酵母中高表达的木聚糖酶XynB和在可见光下呈现红色的荧光蛋白mApple,这两种融合蛋白都可以简化阳性克隆子筛选步骤。在进行重组表达的抗菌肽AP活性检测时,本研究证实融合标签SUMO和mApple对抗菌肽AP的抑菌活性没有影响。本研究成功构建了大肠杆菌表达工程菌Ec-XynB-SDB-AP,枯草芽胞杆菌表达工程菌Bs-SDB-AP。这两种原核表达工程菌引用了自切割的内含肽,成功表达融合蛋白,并摸索出了SDB蛋白的自切割条件,但没有检测到抗菌肽的抑菌活性。另外还构建了毕赤酵母表达工程菌Pp-His-SUMO-AP和Pp-His-mApple-DP-AP,酿酒酵母表达工程菌Sc-His-mApple-DP-AP。真核表达工程菌主要引用了类泛素蛋白SUMO和红色荧光蛋白mApple来融合,SUMO使得抗菌肽的表达更加稳定,mApple使得阳性克隆子的筛选更加便捷,经蛋白电泳检测和抑菌试验,证实抗菌肽在真核表达工程菌中实现了高水平表达和强抑菌性,抑菌圈直径达2.1 cm。通过本研究结果得悉,融合蛋白SUMO和mApple是两种很有效的融合方式,不仅可用于抗菌肽AP的表达,而且还为目前仍然难以表达和检测的蛋白的表达提供了很好的思路和表达策略。对比这几种表达系统发现,真核表达系统可能更加适合抗菌肽AP的表达,其中酿酒酵母表达系统发酵得到的蛋白抑菌活性最强。综上所述,本研究摸索了抗菌肽在不同表达系统中的融合表达效果,获得了有抑菌活性的融合抗菌肽,为工业上规模化生产抗菌肽AP奠定了基础,并为抗菌肽活性的检测方法提供了一定的参考经验。