5-羟色胺4（5-HT4）受体激动剂是一类促进胃动力药,通过兴奋胃肠道胆碱能中间神经元及肌间神经丛的5-HT4受体,促进乙酰胆碱的释放,从而增强胃肠道运动,改善功能性消化不良。主要用于功能性消化不良伴有胃灼热、嗳气、恶心、呕吐、早饱、上腹胀等消化道症状,也可用于胃食管返流性疾病、糖尿病性胃轻瘫及部分胃切除患者的胃功能障碍[1-10]。此类药物中的代表性药物有西沙必利和莫沙必利,其中西沙必利1988年上市后由于心脏毒性已于2000年退市,莫沙必利心脏毒性较弱,目前临床应用广泛[11-16]。此外,宝洁公司新开发的药效更强安全性更高的ATI-7505正在Ⅱ期临床试验阶段[17-19]。SHR116958是新开发的一类胃动力新药,属于苯甲酰胺类的5-羟色胺4受体激动剂,其化学结构（图1）保留了此类药物的苯甲酰胺基本活性结构,侧链替换为己酸喹核酯。此药在分子生物学及细胞学体外筛选活性试验中已显示出比莫沙必利高数十倍的活性,初步体内试验也表现出比莫沙必利吸收速度更快生物利用度更高的优异药代动力学性质,安全性方面的初步试验也表明几乎没有明显毒性反应。本研究的目的是系统地研究SHR116958在大鼠与比格犬体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,阐明SHR116958及其主要代谢物体内药动学特征,为药物的药效、毒理评价及临床新药报批提供资料,也为其他此类化合物的药代动力学研究提供参考和新思路。本研究的主要内容包括:一、建立测定生物样品中SHR116958及其代谢物的方法建立LC/MS/MS方法测定血浆中SHR116958及其代谢物（水解代谢物）的浓度,并进行方法学确证,包括方法的特异性、灵敏度、准确度、定量线性范围、日内及日间精密度、回收率等。同样,针对不同生物样本,在LC/MS/MS方法的基础上,修订和优化药物提取方法,建立各种重要组织器官匀浆、粪、尿、胆汁等生物样本中SHR116958药物浓度的测定方法。二、SHR116958及其代谢物的血药浓度-时间曲线及吸收1、大鼠体内药代动力学大鼠:选择一个剂量（36 mg/kg）进行单次口服给药的药物代谢动力学研究,并选择一个剂量进行静脉注射,计算口服给药在大鼠体内的生物利用度。采血时间点初步定为给药前、给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、36、48h[20]。2、比格犬体内药代动力学①测定单次口服给药高中低3个剂量（10、30、50 mg/kg）的血药浓度-时间图形和相关参数,确定是否存在AUC和Cmax依赖于成正比增高的线性药代动力学,还是非线性药代动力学采血时间点初步定为给药前、给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h;②选择一个剂量进行口服连续7天给药,每天1次,连续7天,比较第1天和第7天时的血药浓度曲线,确定是否存在药物诱导代谢消除速率的加快或抑制,使药代动力学行为随给药次数而变化;③采用自身交叉设计,选择清洗期后的中剂量组比格犬在同等剂量进行单次静脉注射,测定血药浓度-时间图形和相关参数,用此计算口服给药在比格犬体内的生物利用度。三、SHR116958在大鼠体内的分布选择1个剂量组,6只/组大鼠进行口服给药,在药物的吸收、血药浓度达峰、消除等3-4个时间点处死,解剖,提取心、肝、脑、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、脂肪、生殖腺等重要组织、器官进行药物提取和LC-MS/MS药物浓度测定,比较SHR116958在各组织器官中的分布,有无靶向性,获取血脑屏障的通过情况等。四、SHR116958的代谢方式及主要代谢产物采用SHR116958与空白人血浆、肝微粒体酶系统孵育的体外试验方法,确定此药可能存在的代谢方式及主要代谢产物（N-去烷基化代谢物、水解代谢物）。并考察SHR116958在人、猴、犬、大鼠4种属肝微粒体中的代谢稳定性和代谢种属差异,为体内药动学研究、安全性评价、药效学评价实验选择合适的动物模型提供依据。五、SHR116958在大鼠体内的排泄粪尿和胆汁排泄研究:选择1个剂量口服给药进行粪、尿和胆汁排泄研究。六、血浆蛋白结合试验选择高中低3个剂量浓度的药物分别与空白大鼠、比格犬、人血浆、人血清白蛋白、α1-酸性糖蛋白等孵育,采用超过滤法,结合LC/MS/MS测定,研究SHR116958与不同种属动物血浆蛋白的结合情况,为临床用药提供理论依据。七、SHR116958的毒代动力学研究试验设高、中、低和3个剂量组,剂量分别为10、30、60 mg·kg^-1,每组6只动物,雌雄各半。采用口服给药,1次/天,连用30天,共给药30次,给药期限为4周半,研究SHR116958在比格犬体内是否存在蓄积,以及其与剂量之间的关系。本研究的主要结果包括:一、生物样品中SHR116958及其代谢物的LC/MS/MS方法学建立和确证本研究建立了快速、灵敏、易操作的LC/MS/MS法测定大鼠、犬血浆以及大鼠组织等生物样品中的SHR116958及其代谢物的浓度。用盐酸坦洛新为内标,血浆样品经乙酸乙酯萃取,以甲醇:乙腈: 0.1%甲酸水溶液=50:25:25 （v/v/v）为流动相,Angilent Eclipse C18柱（150nm×2.1nm,5μm）进行分离,以高纯氮气作为Curtain gas, collision gas ESI源正离子扫描,MRM扫描方式进行检测。测定犬血浆中SHR116958及M1的线性范围为1-3000 ng·mL^-1。血浆中SHR116958及M1最低定量限为1 ng·mL^-1;大鼠血浆中SHR116958及M1的线性范围为2.71-5560 ng.mL^-1,最低定量限为2.71 ng?mL^-1。本方法专属性好,准确、快速。适用于SHR116958及其代谢物的临床药代动力学研究。二、SHR116958及其代谢物的血药浓度—时间曲线及吸收1、SHR116958及其代谢物在大鼠体内的药物代谢动力学大鼠静脉注射SHR116958后迅速被水解代谢为M1,检测不到其它代谢产物,而且M1的血浆药物浓度明显高于同时间点的原形SHR116958浓度;静脉注射后血浆中SHR116958及代谢物M1药物浓度随时间的变化而迅速下降,呈典型的二项指数型曲线,而且SHR116958及代谢物M1药物浓度变化规律基本一致,大多数个体的血药浓度可检测至24h。SD大鼠口服SHR116958(36 mg·kg^-1)给药的血药浓度与静脉给药相比有大幅降低,8倍于静脉注射剂量口服后,SHR116958和代谢物M1血药的峰浓度仅是静脉注射的8.8%和5.4%,而且吸收不规则,多有双峰现象,表明大鼠口服SHR116958后吸收很低。SD大鼠按4.5 mg·kg^-1剂量静脉注射给药和按36 mg·kg^-1剂量口服给药后原形药SHR116958的主要动力学参数如下:静脉给药组和口服给药组的原形药SHR116958半衰期t1/2分别为（10.8±3.8）和（18±8.9） h;清除率CL分别为（9.6±2.7）和（85.5±19.4） L·h^-1·kg^-1;表观分布容积Vss分别为（53.1±18.6）和（767.9±198.1）L·kg^-1;曲线下面积AUC0～∞分别为（505.6±167.8）和（1397.53±1087.04） ng·h·mL^-1;平均驻留时间MRT分别为（5.5±1.5）和（8.95±1.03）h;峰浓度Cmax分别为（569.8±410.8）和（51.8±23.5）ng·mL^-1;达峰时间Tmax分别为（0.05和2.17±2.29）h,消除速率常数Kel分别为0.07±0.02和0.04±0.02。采用等方差t检验进行比较,具有显著差异的参数有MRT、CL、Vss、Cmax、Tmax。SD大鼠按照4.5 mg·kg^-1剂量静脉注射给药和按照36 mg·kg^-1剂量口服给药后代谢物M1的主要动力学参数如下:静脉给药组和口服给药组的代谢物M1半衰期t1/2分别为（8.4±3.6）和（13.6±2.8）h;清除率CL分别为（4.31±1.64）和（74±18.3 ）L·h^-1·kg^-1;表观分布容积Vss分别为（21.5±10.5）和（597.6±193.3） L·kg^-1;曲线下面积AUC0～∞分别为（1192±491.9）和（513.9±135.9）ng·h·mL^-1;平均驻留时间MRT分别为（4.8±1.07）和（7.96±0.70 ）h;峰浓度Cmax分别为（1472.5±1079.6）和（92.3±49.9）ng·mL^-1;达峰时间Tmax分别为（0.17±0.29）和（0.79±1.10）h,消除速率常数Kel分别为0.09±0.04和0.05±0.01。采用等方差t检验进行比较,具有显著差异的参数有AUC（0-24）、AUC（24-inf）、MRT、CL、Vss、T1/2、Kel、Cmax、Tmax。SD大鼠口服SHR116958(4.5 ng·mL^-1)后SHR116958的生物利用度为9.4%,代谢物M1的生物利用度为4.98%,表明大鼠口服SHR116958后吸收很差。2、SHR116958及其代谢产物在比格犬体内的药代动力学研究比格犬单次口服10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1、50 mg·kg^-1 3个剂量的SHR116958后,其原型药物SHR116958的达峰时间在0.75～1.5 h左右,其达峰浓度分别为（129.8±61.7）、（695.8±87.4）和（1357.5±1338.7）ng.mL^-1,而SHR116958的活性代谢物M1的达峰时间也在0.75～1.5 h左右,其达峰浓度为（208.1±108.0）、（541.8±226.3）和（413.7±606.7）ng·mL^-1,以后呈单项指数消除特征,10 mg·kg^-1剂量组SHR116958及其代谢产物M1血药浓度只能检测至12h,其它两个计量组可检测至24h,检测不到其它代谢产物如M2。由于SHR116958原型药物在血浆中迅速水解为其活性代谢产物M1,在静脉给药中测得的血浆药物浓度较低,代谢物M1的全身暴露水平是SHR116958的6倍并且在8h以后几乎测不到其血药浓度,而活性代谢产物的血浆浓度约是SHR116958的10倍,Cmax是原形SHR116958的18.0倍。而口服给药后,原型药物SHR116958与其代谢物M1的血药浓度差异不是很显著;所以生物利用度的计算选择了活性代谢产物M1的相关药代动力学参数。口服SHR116958后代谢物M1生物利用度为（23.7±9.6）%。比格犬口服SHR116958低、中、高3个剂量组(10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1和50 mg·kg^-1,剂量之比为1:3:5)后, AUC增长比值为1:5.6:10.9;达峰时间Tmax分别为1.33h、1.45h和1.33h; Cmax比值为1:4.1:9.46;平均滞留时间MRT分别为（3.22±0.51）、（4.18±0.46）和（4.15±0.74） h;清除率CL分别为（23.05±7.50）、（11.5±1.68）和（14.24±7.95） L·kg^-1·h^-1;低、中、高3个剂量组末端消除相半衰期t1/2为5.88±4.94、4.94±3.18、4.96±3.09。在10～50 mg·kg^-1的范围内AUC和峰浓度与给药剂量基本成正相关,但稍高于正比例关系。代谢物M1AUC增长比值为1:2.2:5.3;低、中、高3个剂量组血药浓度达峰时间分别1.17 h、1.05 h和1.42 h;Cmax比值为1:2.1:5.8。平均滞留时间MRT分别为（5.08±0.69）、（4.14±2.15）和（4.53±0.95）h;清除率CL分别为（14.60±4.68）、（18.71±6.97）和（11.81±5.85） L·kg^-1·h^-1;低、中、高3个剂量组末端消除相半衰期t1/2为（3.95±1.53） h（,4.96±2.50） h（,5.07±3.39） h。在10～50 mg·kg^-1的范围内AUC和峰浓度与给药剂量成正相关,约为正比例关系,呈明显的线性动力学特征。比格犬连续多次口服SHR116958后第1次给药的药代参数及与第7次给药的药代参数均无明显差异, SHR116958的蓄积因子AUC（0～∞）d7/ AUC（0～∞）d1为0.94,活性代谢物M1的蓄积因子AUC（0～∞）d7/ AUC（0～∞）d1为1.0,表明多次给药后,SHR116958与其代谢物在比格犬体内基本无明显蓄积情况。三、SHR116958及其代谢产物在大鼠体内的组织分布SD大鼠36 mg·kg^-1口服给药SHR116958后,SHR116958的含量按AUC排序由大到小依次为:肝、胃、脾、肾、肺、脂肪、胸腺、卵巢、骨髓、心脏、睾丸、肌肉、血浆、脑。其中在肝的含量最高,胃次之,说明SHR116958经由肝脏代谢,主要分布并作用于靶器官胃,符合其作为胃动力药的特征;其次,通过脑中药物浓度极低可以推断此药不易通过血脑屏障。口服给药后血浆中原形药浓度较低,表明大鼠口服给药后存在明显的首过效应;药物作用的靶点胃组织中药物浓度也非常高,可能是SHR116958被胃组织直接吸收相关。SHR116958水解活性产物M1按AUC排序由大到小依次为:胃、肝、肺、肾、卵巢、血浆、脾、脂肪、骨髓、心脏、睾丸、肌肉、胸腺、脑。胃中代谢物浓度最高,说明原形药SHR116958及其水解后的主要活性产物M1大部分分布于主要靶器官胃,分布规律与原形药大体一致,而与莫沙必利不一致。四、SHR116958的代谢方式及主要代谢产物体外代谢孵育试验表明,SHR116958的代谢具有CYP依赖性,主要由CYP催化代谢。而SHR116958对CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1没有明显抑制作用,对CYP1A2,CYP3A4的IC50值均大于10μΜ,根据文献资料, IC50>10μΜ属于较弱的抑制;1μΜ< IC50<10μΜ属于中等程度抑制;IC50<1μΜ属于强烈抑制,所以SHR116958对人体各主要CYP的抑制较弱。SHR116958在各种属肝微粒体孵育体系中均有显著代谢,共鉴定出9种代谢产物,其中羟基化代谢物和酯水解代谢物为主要代谢物。SHR116958在人肝微粒体代谢速率小于各动物。其中犬与人肝微粒体中代谢物种类及相对数量最为接近。五、SHR116958及其代谢产物在大鼠体内的排泄SHR116958主要以水解活性产物M1的形式通过尿液排出,少量以原形药的形式通过尿和粪排出。48h内尿和粪以代谢物M1的形式的累计排出量分别达到给药量的72.36%和3.78%,尿粪合计排出达到给药量的76.13%。48h内尿和粪以原形药的形式的累计排出量分别达到给药量的13.33%和0.392%,尿粪合计排出达到给药量的13.72%。48h时粪尿中以原形和代谢物M1的形式累及排出的量接近90 %。SHR116958主要以水解活性产物M1的形式通过胆汁排泄,少量以原形药的形式排泄。24h内胆汁以原形和代谢物M1的形式的累计排出量分别达到给药量的3.2%和0.27 %, 24h时胆汁中以原形和代谢物M1的形式累及排出的量为3.5 %,与最终从粪便排泄量相当。六、SHR116958及其代谢产物的血浆蛋白结合SHR116958及其水解活性产物M1与人血浆、大鼠血浆和犬血浆蛋白结合率在97-99%之间,种属之间血浆蛋白结合差别不大,略高于人血清白蛋白（HSA）的结合率,表明SHR116958及其水解活性产物M1除与血浆中的主要结合蛋白白蛋白结合外,还有少部分可能与其它结合蛋白如α1-酸性糖蛋白、脂肪、蛋白结合,同时说明SHR116958及其代谢产物M1主要与血浆中的白蛋白结合。七、SHR116958及其代谢产物的毒代动力学比格犬口服SHR116958后SHR116958、代谢物M1血药浓度随剂量的加大而增高,第1次与第30次相同时间点的血药浓度经配对t-检验后,大部分时间点血药浓度的差别无统计学意义（P > 0.05）。第1次给药后比格犬低、中、高剂量组的SHR116958平均AUC（0-t）值为（3884.9±1974.8）、（21731.7±17764.6）和（56985.9±29413）ng·h·mL^-1,第30次给药后比格犬低、中、高剂量组的SHR116958平均AUC（0-t）值为（18190.3±1786.9）、（52792.7±16381.3）和（77844.2±21821.2）ng·h·mL^-1。第1次给药后比格犬低、中、高剂量组的SHR116958的Cmax值为（1974.2±1226.2）、（12561.7±11279.9）和（28733.3±23867）ng·mL^-1,30次给药后SHR116958低、中、高剂量组的Cmax值为（1799.2±560.8）、（8250.0±2738.4）和（15205±4750.2）ng·mL^-1。第1次给药后比格犬低、中、高剂量组的M1平均AUC（0-t）值为（1310.3±677.8）、（4095.6±1451.7）和（12212.5±4496.5） ng·h·mL^-1,第30次给药后比格犬低、中、高剂量组的M1平均AUC（0-t）值为（ 4039.4±359.2）、（10917.8±1578.6）和（18628.0±1038.6） ng·h·mL^-1。第1次给药后比格犬低、中、高剂量组的M1的Cmax值为（466.7±282.3）、（1479.2±495.3）和（3349.2±868.8） ng·mL^-1,第30次给药后M1的Cmax值为（1195.0±177.1）、（3103.3±521.1）和（7145.0±1026.7） ng·mL^-1。连续30次给药后,SHR116958的蓄积系数低、中、高剂量组分别为4.68、2.43、1.37; M1的蓄积系数低、中、高分别为3.08、2.67、1.52。