前言胰腺癌由于解剖位置特殊和生物学侵袭性高，症状缺乏特异性，易发生早期转移，因而确诊时多属晚期，除了手术之外，尚无其他的有效治疗方法。术后5年生存率不到5％，是预后最差的消化道恶性肿瘤之一。同其他肿瘤一样，胰腺癌的发生、发展是一个多阶段，受多基因调控的过程，由多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。因此要了解癌变过程中的基因变化，需要研究整个基因组的异常。基因组DNA的片段扩增或缺失在肿瘤的发生、发展中起是引重要作用。最初检测基因组范围内基因拷贝数异常的方法是比较基因组杂交(comparative genomichybridization，CGH)，原理是用两份标记不同荧光素的样品(实验样品和对照样品)同时进行杂交，通过比较荧光信号强度，从而快速又直观地检测实验样品和对照样品之间基因组DNA的拷贝数量的差异。在此基础上发展起来的比较基因组杂交芯片(array CGH)将解析度从大约20Mb提高到＜1 Mb，近期出现的一种含有32，433细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)芯片解析度提高到80 kb。但是这种检测方法的主要缺陷是CGH只能检测到扩增或缺失数目的异常，但不能发现Allelic homozygosity(AH)，即一个等位基因缺失，而余下的一个等位基因扩增，基因数目没有变化。这需要研究杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。所谓杂合性缺失即一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现突变或缺失，在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异，抑癌基因的杂合性缺失会导致肿瘤的发生。因此分析肿瘤组织LOH为定位和发现抑癌基因的有效手段。全基因组扫描LOH传统方法包括微卫星标记法(polymorphic microsatellite markers)和限制性片段长度多态性标记(restriction fragnnent length polymorphisms，RFLPs)。但是这两种方法的缺点是操作费时费力，需要大量的样本DNA，检测能力受制于marker的量。检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以突破这种限制。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，是继微卫星标记之后的第三代遗传标记。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+／-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。由于SNP遍布于整个人类基因组中及其二态性自身的特性决定了它适合于快速、规模化筛查。Affymetrix公司推出的GeneChip Human Mapping 100K Array涵盖了从TSC(The SNP Consortium)数据库挑选出的116，204个SNP位点，SNP位点间的中位(median)物理距离接近8.5 kb，平均间距是23.6 kb。这些SNPs的平均杂合性是0.30。此芯片通过高通量测定基因组SNP位点，在检测基因组DNA的片段扩增或缺失数目变化的同时可以检测杂合性缺失，提供一个全基因组的“扫描图”，直观地表现出被检测品整个染色体组的改变。数目缺失或杂合性缺失部位可能包含抑癌基因，而扩增片段则可能存在致癌基因。分析软件名为Copy Number Analyzer for theAffymetrix GeneChip Mapping 100K array(CNAG)优化了对照组的选择，不需要从同一患者取正常组织作为对照，这使研究细胞株基因组的基因数目变化和杂合性缺失成为可能。为了揭示胰腺癌发生的分子机制，提高早期诊断和提供治疗新方法，我们应用高密度的单核苷酸多态性分析芯片，研究25种胰腺癌细胞株基因组的基因扩增，缺失，以及杂合性缺失等染色体异常。材料与方法一、材料我们研究了25种人类胰腺癌细胞株，分别来自美国，日本和欧洲的细胞库。其中16种(AsPC-1，BxPC-3，Capan-1，Capan-2，CFPAC-1，HPAF-Ⅱ，Hs 700T，Hs766T，PANC-1，Panc 02.03，Panc 03.27，Panc 05.04，Panc 08.13，Panc 10.05，SU.86.86，和SW 1990)是从美国American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA)获得，5种(KP-1N，KP-2，KP-3，KP-4，and MIA PaCa-2)从日本的Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB，Osaka，Japan)获得，KLM-1和NOR-P1来自日本的Institute of Development，Aging and Cancer，Tohoku University，Japan．T3M-4和PSN1分别来自日本RIKEN BioResource Center(Tsukuba，Japan)和欧洲European Collection of Cell Cultures(ECACC，Salisbury，UK)。细胞在推荐的培养基中培养。二、主要试剂及仪器DNA提取试剂盒PUREGENE DNA Isolation Kit(Gentra Systems，Minneapolis，MN)。SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂。Affymetrix基因芯片系统包括Affymetrix全自动芯片洗涤工作站，Affymetrix高分辨率芯片扫描仪，Affymetrix杂交箱。实时荧光定量PCR系统是ABI PRISM 7000 Sequence Detection System。PCR仪是Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600．三、芯片制作和分析从细胞株中提取DNA，用2种限制性内切酶XbaⅠ或HindⅢ消化，末端连接adapter后进行PCR。PCR产物片断化后，末端进行标志(labeling)，然后与Affymetrix公司的GeneChip(?) Human Mapping 100K Mapping microarray上的探针杂交。检测基因芯片上的近100，000个的SNP探针的荧光信号，应用CNAG软件，分析胰腺癌基因组的扩增，缺失，以及杂合性缺失(LOH)。四、芯片结果验证详细分析25种胰腺癌细胞的数据，筛选可能与胰腺癌发生和发展有关的基因，用PCR验证缺失，实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)确认扩增。结果一、染色体DNA片段扩增出现在2种以上细胞的共同扩增区域有23处。最小扩增区域为146kb。最普遍的扩增片段在12p12.1-12p11.23，出现在6种细胞株中。平均每个区域有4.87个基因。其中，1q42.2-q42.3，2q36.3，3q25.1，5p15.2，10q23.32，11q21，13q22.2，19p13.12是新发现的区域。二、染色体DNA片段纯合性缺失(homozygous deletions)25种胰腺癌细胞株基因组中，发现并证实26个区域有DNA片段纯合性缺失，其中20个区域只有1个候选基因，4处有2个候选基因，2处有4个候选基因，平均每个区域有1.38个基因。最小纯合性缺失片段长度是6kb，最普遍的片段在9p21.3，出现在11种细胞株中。新发现了7个纯合性缺失片段，分别位于2q22.1，6q22.33，9q22.33，20p12.1，Xp21.2)，Xp21.1，Xq26.3。三、杂合性缺失所有的肿瘤细胞都有不同程度的杂合性缺失，高频率的(50％以上)LOH出现在9p，18q，17p，8p，13q，6q，3p，6p，22q，9q，12q等处。最普遍的区域是在9p和18q，出现在22种细胞株中。结论1、应用Affmetrix GeneChip(?) Human Mapping 100K基因芯片和分析软件CNAG，可以同时详细分析胰腺癌的基因缺失，扩增和LOH。2、高密度的单核苷酸多态性芯片筛选出多处胰腺癌相关基因，表明多个基因参与了胰腺癌的发生，发展过程。3、新发现的扩增和纯合性缺失以及杂合性缺失区域可能含有新的癌基因或抑癌基因，为今后的研究提供了新的线索和方向。