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日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV),又称乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒),是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的一员,主要引起人类或马的中枢神经系统感染以及猪的流产,能通过持续感染的蚊子传播给人,并且主要在脊椎动物宿主内存在,特别是具有较高病毒血症的猪和鸟类。在人类乙脑主要引起致死率较高的脑炎,致死率在20-50%之间,但是绝大多数的幸存者都留有中枢神经系统的后遗症,在家养动物如猪和马,主要引起脑炎、流产甚至死亡。猪是主要中间宿主和扩散宿主,也是主要的传染源。同时,近些年全球乙脑流行区域呈现扩大之势,我国乙脑发病地区也有明显扩展。WHO已将乙脑纳入全球重点防控疾病。许多研究表明,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,预防猪感染乙脑是防控人患乙脑的重要措施,因群中流行性乙型脑炎病原学调查和流行的乙脑病毒株分子生物学特性研究尤为重要,更为开发猪源的乙脑疫苗打下基础。鉴于此病的流行和传播特点,本实验首次尝试了新的分离乙脑病毒的方法,全面的分析了当前在我国上述五个省市流行的乙脑病毒的流行特点和分子生物学特性。论文的主要研究内容主要包括以下几个方面：1病毒分离从江苏、浙江、上海、山东和安徽5个省市不同的58家猪场采集蚊子、病猪血液和发病公猪精液,蚊子样品存放轻便液氮灌保存和运输,血液和精液冷藏运输,送实验室后立即处理采集病料,结合BHK-21细胞传代和乳鼠脑内接种盲传病毒,细胞上盲传4-5代后出现规则细胞病变(CPE),小鼠脑内接种引起神经症状或表现为乙脑症状者保存毒种。结果从58份病料中分离出疑似病毒21株。2分离病毒的鉴定在铺满单层BHK-21细胞的96孔板上做间接免疫荧光,用羊抗兔的荧光抗体(IgG-FITC)染色,在荧光显微镜下观察鉴定；参考GenBank中乙脑病毒基因序列,利用DNAstar(version5.0)软件找出一段保守序列,应用Primer5.0软件设计合成JEV M区基因的一对特异性检测引物,通过PT-PCR扩增条带,测序鉴定；进而根据JEV(M-E)区基因设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增条带,回收产物、连接PMD-18T载体并测序。结果从21份疑似病毒株中分离出15株乙脑病毒。3分离病毒株的生物学特性分析根据Woan-Ru Chen建立的方法进行基因分型分析。结果显示本次实验所分离的15株乙脑病毒均属于基因型III型；新分离15株病毒E蛋白的氨基酸和核苷酸之间的同源性较高,核苷酸同源性为99%-99.9%,氨基酸同源性为97.8%-100%。15株新分离毒株与乙脑病毒疫苗株P3株比较,氨基酸的同源性为96%-97%；与弱毒疫苗株SA14-14-2株比较,氨基酸的同源性为96.8%-98%。所有毒株在核苷酸序列上的差异均为碱基的替换,所有核苷酸或氨基酸均无插入或丢失。大多数核苷酸变异在氨基酸编码的第三位,属于沉默突变,不引起氨基酸改变。新分离病毒经噬斑纯化、鼠脑接种和连续5次细胞传代后,病毒在BHK-21细胞上的繁殖特性趋于稳定,新分离15株乙脑病毒在感染BHK-21习胞后都能使细胞发生变圆、量度增加、拉网、脱落等特异性的细胞病变(CPE),产生病变时间稳定在48小时左右；在BHK-21细胞上有相似的病毒滴度(106.1-106.8TCID50)；对9-11g小鼠脑内接种30ul,104TCID50的新分离病毒,得到不同的致死率(60%-80%)。结果表明：在相同时间相同地理位置分离的乙脑病毒有非常高的同源性,但是随着时间和地理位置的变化JEV发生了基因突变；新分离病毒株表现相似的细胞适应性和病毒滴度,但神经毒性略有差异。