论文部分内容阅读
MicroRNAs(miRNAs)是一类大小约为22个核苷酸的内源性非编码小RNA，作为转录后基因调节器，通过调控其靶mRNA参与调节生物的发育、细胞的分化、增殖、凋亡等。近年来的种种研究表明miRNAs与肿瘤的发生、发展及化疗耐药关系十分密切，其中microRNA-21(miR-21)被证实在包括肺癌在内的多种肿瘤组织中呈高表达。本研究通过设计并合成针对miR-21的反义寡核苷酸(miR-21antisense oligonucleotide，AS-miR-21)，观察其对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞生物学特征的影响，并通过对miR-21下游靶基因的研究，阐明AS-miR-21在NSCLC发生、发展中的作用机制，从而为NSCLC的生物靶向治疗提供新的思路和依据。
第一部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞生物学行为的影响
目的:研究AS-miR-21对NSCLC A549细胞体外增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期及形态等生物学行为的影响。
方法:选取对数生长期的NSCLC A549细胞，分为AS-miR-21组(AS-miR-21group)，阴性对照组(miR-NC group)和空白对照组(Blank group)，首先通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞miR-21表达的影响，然后分别通过MTT（四甲基偶氮唑盐比色）实验、流式细胞术(FCM)、细胞克隆（集落）形成实验、细胞划痕愈合实验及Transwell小室实验观察AS-miR-21对NSCLCA549细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移等生物学行为的影响，并用倒置光学显微镜观察各组细胞形态。
结果:与阴性对照组和空白对照组比较，qRT-PCR结果表明AS-miR-21组miR-21表达下调(p＜0.05);MTT结果显示AS-miR-21显著抑制细胞增殖能力(p＜0.05);细胞周期结果表明AS-miR-21阻滞A549细胞于G0/G1期，而S期细胞数目则显著减少;细胞克隆（集落）形成实验表明，AS-miR-21显著减少细胞克隆形成数目(p＜0.01);FCM显示AS-miR-21显著增加细胞凋亡率(p＜0.01);Transwell实验表明AS-miR-21显著降低A549细胞的侵袭能力(p＜0.01);细胞划痕愈合实验显示AS-miR-21显著抑制A549细胞的迁移率(p＜0.01)。倒置光学显微镜下观察到阴性对照组和空白对照组A549细胞紧贴瓶壁，生长良好。边缘轮廓清晰，胞质丰富增殖速度快，排列致密。AS-miR-21组A549细胞均表现出不同程度的变圆、固缩，胞间隙增大，脱落及破碎的细胞逐渐增多，悬浮于培养基中。
结论:AS-miR-21通过下调miR-21表达促进NSCLC A549细胞凋亡并抑制A549细胞增殖、迁移及侵袭。
第二部分 AS-miR-21调控NSCLC A549细胞增殖、凋亡、侵袭的分子机制研究
目的:探讨AS-miR-21调控NSCLCA549细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的分子机制。
方法:参考文献并结合targetscan、pictar、miRanda等在线生物信息学软件分析预测miR-21可能的靶基因，进一步应用双荧光素酶报告基因实验确定miR-21直接识别PTEN mRNA3’-UTRs。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AS-miR-21对A549细胞中PTEN mRNA表达的影响。应用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和蛋白质免疫印迹法(Western blot，WB)分别检测AS-miR-21对A549细胞中PTEN、PI3K、Akt表达的影响。
结果:双荧光素酶报告基因实验确定PTEN是miR-21的直接靶基因;与阴性对照组和空白对照组比较，荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，AS-miR-21对A549细胞中PTEN mRNA的表达无明显影响，差异无统计学意义(p＞0.05);而IHC和WB结果均显示，AS-miR-21显著上调A549细胞中PTEN的表达(p＜0.01)，下调A549细胞中PI3K和Akt的表达(p＜0.01)。
结论:AS-miR-21可能通过PTEN/PI3K/Akt信号转导通路调控NSCLC A549细胞增殖、凋亡及侵袭。
第三部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和血管生成的影响
目的:进一步研究AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和瘤内血管生成的影响。
方法:将20只4周裸鼠适应性饲养一周后，分别皮下注射0.2ml细胞计数为107个/mlA549细胞悬液，第15d待移植瘤长至约70mm3大小时，选取瘤体接近的15只裸鼠，随机分为以下3组:空白对照组(Blank group)、阴性对照组(miR-NC group)和实验组(AS-miR-21group)，每三天分别给予相应组别裸鼠移植瘤内缓慢多点注射F12K培养液、miR-NC+F12K培养液、AS-miR-21+F12K培养液，给药5次，同时测量记录裸鼠质量、肿瘤体积。于末次给药3d后处死裸鼠，取出移植瘤，称重;苏木素-伊红（HE）染色观察各组移植瘤病理变化;采用CD34免疫组化染色测定肿瘤组织内微血管密度(MVD)，观察各组移植瘤新生血管情况。
结果:成功建立NSCLCA549细胞裸鼠皮下移植瘤模型，AS-miR-21组移植瘤质量和体积显著低于空白对照组和阴性对照组(p＜0.01)。裸鼠移植瘤HE染色后，在光学显微镜下观察肿瘤细胞核大、深染，可见核分裂相。与空白对照组和阴性对照组相比较，AS-miR-21组可见细胞减少，大小不一，核固缩碎裂。肿瘤微血管密度(MVD)结果显示:空白对照组和阴性对照组有较多血管内皮细胞CD34染色阳性，癌组织内多量微血管呈棕黄色至棕褐色，深染，逗点状、小管状或条索状，AS-mi-21组血管内皮细胞CD34染色阳性明显较少。MVD计数结果分别为:102±23，108±22，32±9。说明AS-miR-21能显著抑制肿瘤新生血管的形成(p＜0.01)。
结论:AS-miR-21能够在体内显著抑制NSCLC A549细胞生长及瘤内血管的生成。
第四部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和血管生成的机制研究
目的:探讨AS-miR-21抑制NSCLC A549细胞裸鼠移植瘤生长及瘤内血管生成的可能作用机制。
方法:建立NSCLC A549细胞裸鼠移植瘤模型，按随机数字表法分为分为3组:空白对照组(Blank group)、阴性对照组(miR-NC group)及实验组(AS-miR-21group);于末次给药3d后处死裸鼠，取出移植瘤。qRT-PCR检测各组miR-21、PTEN、VRGF、VEGFR、MMP-2和MMP-9mRNA的表达水平;免疫组织化学染色方法（SP法）检查移植瘤内p53、bax、bcl-2、VEGF、MMP-2及MMP-9的表达;Western blot法测定PTEN、PI3K、Akt、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量。
结果:qRT-PCR结果显示，AS-miR-21能显著下调A549细胞移植瘤miR-21表达量(p＜0.01)，PTEN mRNA表达量与空白对照组比较无显著性差异(p＞0.05);免疫组织化学染色法(SP法)表明，AS-miR-21能显著抑制bcl-2、VEGF、MMP-2及MMP-9蛋白表达，增加p53和bax蛋白表达;Western blot法结果显示，AS-miR-21能显著上调A549细胞移植瘤PTEN蛋白表达量，下调PI3K、Akt、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量。
结论:AS-miR-21可能通过PTEN/PI3K/Akt信号传导通路抑制NSCLC A549细胞移植瘤的生长及肿瘤血管的形成。
第一部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞生物学行为的影响
目的:研究AS-miR-21对NSCLC A549细胞体外增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期及形态等生物学行为的影响。
方法:选取对数生长期的NSCLC A549细胞，分为AS-miR-21组(AS-miR-21group)，阴性对照组(miR-NC group)和空白对照组(Blank group)，首先通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞miR-21表达的影响，然后分别通过MTT（四甲基偶氮唑盐比色）实验、流式细胞术(FCM)、细胞克隆（集落）形成实验、细胞划痕愈合实验及Transwell小室实验观察AS-miR-21对NSCLCA549细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移等生物学行为的影响，并用倒置光学显微镜观察各组细胞形态。
结果:与阴性对照组和空白对照组比较，qRT-PCR结果表明AS-miR-21组miR-21表达下调(p＜0.05);MTT结果显示AS-miR-21显著抑制细胞增殖能力(p＜0.05);细胞周期结果表明AS-miR-21阻滞A549细胞于G0/G1期，而S期细胞数目则显著减少;细胞克隆（集落）形成实验表明，AS-miR-21显著减少细胞克隆形成数目(p＜0.01);FCM显示AS-miR-21显著增加细胞凋亡率(p＜0.01);Transwell实验表明AS-miR-21显著降低A549细胞的侵袭能力(p＜0.01);细胞划痕愈合实验显示AS-miR-21显著抑制A549细胞的迁移率(p＜0.01)。倒置光学显微镜下观察到阴性对照组和空白对照组A549细胞紧贴瓶壁，生长良好。边缘轮廓清晰，胞质丰富增殖速度快，排列致密。AS-miR-21组A549细胞均表现出不同程度的变圆、固缩，胞间隙增大，脱落及破碎的细胞逐渐增多，悬浮于培养基中。
结论:AS-miR-21通过下调miR-21表达促进NSCLC A549细胞凋亡并抑制A549细胞增殖、迁移及侵袭。
第二部分 AS-miR-21调控NSCLC A549细胞增殖、凋亡、侵袭的分子机制研究
目的:探讨AS-miR-21调控NSCLCA549细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的分子机制。
方法:参考文献并结合targetscan、pictar、miRanda等在线生物信息学软件分析预测miR-21可能的靶基因，进一步应用双荧光素酶报告基因实验确定miR-21直接识别PTEN mRNA3’-UTRs。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AS-miR-21对A549细胞中PTEN mRNA表达的影响。应用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和蛋白质免疫印迹法(Western blot，WB)分别检测AS-miR-21对A549细胞中PTEN、PI3K、Akt表达的影响。
结果:双荧光素酶报告基因实验确定PTEN是miR-21的直接靶基因;与阴性对照组和空白对照组比较，荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，AS-miR-21对A549细胞中PTEN mRNA的表达无明显影响，差异无统计学意义(p＞0.05);而IHC和WB结果均显示，AS-miR-21显著上调A549细胞中PTEN的表达(p＜0.01)，下调A549细胞中PI3K和Akt的表达(p＜0.01)。
结论:AS-miR-21可能通过PTEN/PI3K/Akt信号转导通路调控NSCLC A549细胞增殖、凋亡及侵袭。
第三部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和血管生成的影响
目的:进一步研究AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和瘤内血管生成的影响。
方法:将20只4周裸鼠适应性饲养一周后，分别皮下注射0.2ml细胞计数为107个/mlA549细胞悬液，第15d待移植瘤长至约70mm3大小时，选取瘤体接近的15只裸鼠，随机分为以下3组:空白对照组(Blank group)、阴性对照组(miR-NC group)和实验组(AS-miR-21group)，每三天分别给予相应组别裸鼠移植瘤内缓慢多点注射F12K培养液、miR-NC+F12K培养液、AS-miR-21+F12K培养液，给药5次，同时测量记录裸鼠质量、肿瘤体积。于末次给药3d后处死裸鼠，取出移植瘤，称重;苏木素-伊红（HE）染色观察各组移植瘤病理变化;采用CD34免疫组化染色测定肿瘤组织内微血管密度(MVD)，观察各组移植瘤新生血管情况。
结果:成功建立NSCLCA549细胞裸鼠皮下移植瘤模型，AS-miR-21组移植瘤质量和体积显著低于空白对照组和阴性对照组(p＜0.01)。裸鼠移植瘤HE染色后，在光学显微镜下观察肿瘤细胞核大、深染，可见核分裂相。与空白对照组和阴性对照组相比较，AS-miR-21组可见细胞减少，大小不一，核固缩碎裂。肿瘤微血管密度(MVD)结果显示:空白对照组和阴性对照组有较多血管内皮细胞CD34染色阳性，癌组织内多量微血管呈棕黄色至棕褐色，深染，逗点状、小管状或条索状，AS-mi-21组血管内皮细胞CD34染色阳性明显较少。MVD计数结果分别为:102±23，108±22，32±9。说明AS-miR-21能显著抑制肿瘤新生血管的形成(p＜0.01)。
结论:AS-miR-21能够在体内显著抑制NSCLC A549细胞生长及瘤内血管的生成。
第四部分 AS-miR-21对NSCLC A549细胞移植瘤的生长和血管生成的机制研究
目的:探讨AS-miR-21抑制NSCLC A549细胞裸鼠移植瘤生长及瘤内血管生成的可能作用机制。
方法:建立NSCLC A549细胞裸鼠移植瘤模型，按随机数字表法分为分为3组:空白对照组(Blank group)、阴性对照组(miR-NC group)及实验组(AS-miR-21group);于末次给药3d后处死裸鼠，取出移植瘤。qRT-PCR检测各组miR-21、PTEN、VRGF、VEGFR、MMP-2和MMP-9mRNA的表达水平;免疫组织化学染色方法（SP法）检查移植瘤内p53、bax、bcl-2、VEGF、MMP-2及MMP-9的表达;Western blot法测定PTEN、PI3K、Akt、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量。
结果:qRT-PCR结果显示，AS-miR-21能显著下调A549细胞移植瘤miR-21表达量(p＜0.01)，PTEN mRNA表达量与空白对照组比较无显著性差异(p＞0.05);免疫组织化学染色法(SP法)表明，AS-miR-21能显著抑制bcl-2、VEGF、MMP-2及MMP-9蛋白表达，增加p53和bax蛋白表达;Western blot法结果显示，AS-miR-21能显著上调A549细胞移植瘤PTEN蛋白表达量，下调PI3K、Akt、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量。
结论:AS-miR-21可能通过PTEN/PI3K/Akt信号传导通路抑制NSCLC A549细胞移植瘤的生长及肿瘤血管的形成。