瘤胃酸中毒是现代反刍动物养殖过程中常出现的疾病,给反刍动物生产带来巨大的损失。瘤胃酸中毒状态下,瘤胃内短链脂肪酸或乳酸浓度升高、pH值降低、瘤胃粘膜出现糜烂、溃疡、瘤胃乳头大面积脱落,有毒物质进入血液的途径增加,最终降低了动物解毒机能和屏障功能。有研究证实,瘤胃屏障的破坏与细胞凋亡的增加相关,丁酸是瘤胃微生物发酵产生的一类重要的脂肪酸,高浓度丁酸是引起瘤胃酸中毒特别是亚急性瘤胃酸中毒发生的重要诱因。丁酸对诱导细胞凋亡方面也有促进作用,说明丁酸可能与瘤胃屏障的破坏有关。烟酸是一种维生素类营养物质,对缓解瘤胃酸中毒,提高肥育肉牛生产性能有效果,但烟酸对瘤胃上皮细胞凋亡是否有保护作用目前还未见报道。本试验通过体外原代细胞培养技术,以原代瘤胃上皮细胞(Ruminal Epithelium Cell,REC)作为研究对象,研究丁酸及添加烟酸对瘤胃上皮细胞细胞活力、细胞凋亡、氧化应激、凋亡相关基因的影响,并进一步探讨其调控机制与通路。为此,本文进行如下试验:(1)通过不同处理对REC进行消化分离和原代培养,优化并选择最适宜的条件。结果显示,取小于30 d日龄动物用0.1%I型胶原酶+0.25%胰蛋白酶分步消化法进行瘤胃上皮细胞分离培养,效果最佳。(2)添加不同浓度丁酸处理,通过对细胞活力和细胞凋亡进行检测,确定丁酸的添加量。结果显示,20 mmol/L丁酸对REC的细胞活力有提高的作用,而40~140mmol/L丁酸处理后降低了REC的细胞活力。凋亡检测分析发现,120 mmol/L丁酸培养6 h可诱导瘤胃上皮细胞发生凋亡,显著提高细胞凋亡指数。(3)在120 mmol/L丁酸培养下添加不同浓度烟酸培养6 h以确定烟酸的最佳添加量。结果显示,20~80 mmol/L烟酸能有效抑制丁酸引起的瘤胃上皮细胞活力下降,其中40 mmol/L烟酸效果最佳;当烟酸浓度大于100 mmol/L时,则呈现细胞毒性,对促进细胞活力无明显效果。(4)研究丁酸及添加烟酸对REC氧化应激、凋亡指数、凋亡相关基因表达的影响。氧化应激检测结果显示,丁酸提高了REC细胞内活性氧的含量,降低了细胞内总抗氧化能力,与对照组比较差异均极显著(P<0.01)。添加烟酸则降低了ROS的含量,提高了细胞内总抗氧化能力,与丁酸组比较差异均极显著(P<0.01)。说明,120mmol/L丁酸能引起REC发生氧化应激,添加40 mmol/L烟酸能缓解丁酸诱导的REC氧化应激。流式检测结果显示丁酸显著提高了细胞的凋亡指数(P<0.05),添加烟酸降低了细胞的凋亡指数,与丁酸组比较差异极显著(P<0.01),表明烟酸能降低凋亡的发生率。基因检测结果显示,丁酸上调了线粒体诱导凋亡途径中Caspase-9、Bax基因的表达,下调了Bcl-2基因的表达,提高了Bcl-2/Bax比值;对受体诱导凋亡途径中Caspase-8和Fas基因的表达无影响;上调了调控基因p53的表达(P<0.01),对PARP-1基因的表达无影响。说明丁酸诱导瘤胃上皮细胞的凋亡机制可能主要是上调p53基因的表达,介导调控线粒体膜孔的开放,活化凋亡蛋白酶Caspase-9来实现细胞凋亡的。而添加烟酸下调了p53(P<0.01)和Caspase-3(P<0.05)基因的表达,下调了Caspase-9、Bax、Fas基因的表达和上调了Bcl-2的表达,并上调了Bcl-2/Bax比值,但差异不显著(P>0.05),对Caspase-8和PARP-1基因的表达无影响。说明添加烟酸能降低凋亡相关基因的表达,其保护机制可能与下调p53基因的表达,抑制线粒体凋亡通路激活有关。综合上述结果,较高浓度(120 mmol/L)丁酸显著的引起细胞活力的降低、凋亡指数的增加、细胞内ROS的增加和T-AOC的降低。此外,添加40 mmol/L烟酸处理后,发现丁酸引起的上述事件均得到有效的抑制,进一步确认了丁酸是通过氧化应激来介导细胞发生凋亡,而烟酸能够抑制丁酸诱导瘤胃上皮细胞发生凋亡,其机制可能是通过降低细胞内ROS水平,缓解细胞内氧化应激,抑制ROS诱导的线粒体凋亡途径来达到保护细胞的作用。