蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)可感染不同发育阶段的蜜蜂,发病蜂主要表现为翅膀残缺、腹部缩短、体色异常。因该病流行强度大,宿主范围广,给养蜂业造成了巨大经济损失。开展本病的快速检测和免疫制剂的研发,是科学防治本病的基础。为建立DWV快速诊断方法,本实验选取DWV基因组中的3C-Rd Rp基因高度保守区段作为靶基因,设计合成特异性上下游引物,以含靶基因序列的p MD18T-CA质粒作为标准品,建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法,并对引物浓度、退火温度、时间等条件进行了优化。结果表明:该检测方法的最佳引物浓度为500 nmol/L,最佳退火温度为59℃,退火时间为30 s;敏感性试验表明,该方法检测DWV的最低检测量为10个拷贝数,比普通RT-PCR方法敏感性提高10倍;特异性试验表明,建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法检测CSBV、CBPV、IPAV均为阴性,但检测DWV为阳性;重复性试验结果显示,批内和批间变异系数均小于2.0%。利用建立的荧光定量RT-PCR方法和普通RT-PCR方法检测了来自辽宁、安徽和江苏等地的36个临床样本,结果显示两种检测方法检测的总符合率达91.6%。荧光定量RT-PCR检测病毒结果显示,所建立的方法特异性强、敏感度高、重复率好,具有快速检测疾病和病毒定量特点,该方法具有潜在的临床应用前景。为探讨DWV主要结构蛋白的免疫原性,本实验以DWV-LN核酸序列为模板,设计了针对结构蛋白基因VP1、VP2和VP3的3对特异性引物序列,通过RT-PCR扩增了DWV-LN株三个主要结构蛋白基因,并进行测序。结果显示,VP1、VP2和VP3的3个结构蛋白与参考毒株氨基酸同源性在96.9%-99.3%,96.5%-98.1%和95.9%-99.2%之间,分别由416、225和246个氨基酸组成。根据大肠杆菌密码子的偏嗜性,对编码3个结构蛋白的氨基酸密码子进行了优化,并构建了重组原核表达系统p ET28-VP1-OPTI/BL21(DE3)、p ET28-VP2-OPTI/BL21(DE3)和p ET28-VP3-OPTI/BL21(DE3)。经诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测,获得了与预期大小相一致的r VP1 50.5 k Da、r VP2 29.1 k Da和r VP3 32.6 k Da目的蛋白。表达蛋白分别经Ni-NTA亲和柱纯化后,纯化蛋白皮下多点免疫小鼠3次后,间接ELISA测定小鼠血清Ig G水平,并将三个重组蛋白制备的抗体与DWV孵育后接种健康蜂蛹,检测抗体中和病毒的效力,评价重组蛋白的免疫原性。结果表明,r VP3免疫小鼠产生高效价的Ig G水平,且对病毒的中和效价高于r VP1和r VP2两种蛋白制备的抗血清,表明r VP3重组蛋白具有较好的免疫原性。为研究特异性抗体的抗病毒效应,达到治疗或预防本病的目的。以r VP3为免疫原,经腿肌和胸肌免疫接种不同剂量的海兰褐壳蛋鸡,每2周免疫1次,共免疫4次,在免疫后8周收集鸡蛋和采集血清,进行抗体检测。实验结果显示,卵中IgY水平与血清抗体水平变化规律较为一致。为验证anti-r VP3 IgY中和病毒能力,将2~1-2~5效价的IgY分别与1×10~4copies/μL DWV孵育,接种8-9日龄健康蜂蛹,进行病毒中和试验,接种72 h后检测接种幼虫体内DWV拷贝数。结果表明:IgY效价为2~5的IgY具有良好的中和病毒作用。以制备的anti-r VP3 IgY进行了DWV的治疗试验。分别对幼虫接种DWV前和后24小时分别饲喂不同效价IgY。结果显示:经口服效价大于或等于2~3的IgY,饲喂72 h后均能够显著降低DWV幼虫体内病毒感染的拷贝数,且随IgY效价提高抑制病毒复制的作用也增强,当IgY效价为2~5,抑制病毒复制的效果最佳。本实验采用2~5效价的IgY作为临床治疗剂量,选取辽宁清源地区和兴城地区已确诊感染DWV的20个蜂群作为试验群,饲喂IgY 3次,间隔1d,治疗12d后观察临床治疗效果。结果显示,病毒拷贝数显著降低,治疗后蜜蜂体内病毒拷贝数下降至治疗前的1/80-1/100倍,显示了良好的临床治疗效果。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测DWV方法和研制的抗病毒复制的卵黄抗体,为DWV的快速诊断和该病的预防与治疗提供了重要的物质基础。