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背景上皮钠离子通道(epithelial sodium channel,ENaC)是具有阿米洛利敏感性、非电压门控离子通道退化蛋白家族中的一个成员,由α、β、γ和δ四种亚单位组成的异源多聚体蛋白,其主要生理功能是跨越紧密相连的上皮单向地转运Na~+,调节水和离子的转运。Ⅱ型肺泡上皮细胞是成年肺的干细胞,在肺损伤修复中起着重要作用,α-ENaC广泛分布于Ⅱ型肺泡上皮细胞。研究表明,α-ENaC参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、细胞分化以及肺水肿的发生等。但对α-ENaC在Ⅱ型肺泡上皮细胞的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合SSA-RPG阳性克隆筛选报告载体构建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系(L2细胞系),检测基因敲除后细胞增殖、迁移能力以及基因表达谱的变化,进而阐明α-ENaC在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系中的功能和作用。方法1.利用在线分析软件(http://benchling.com),设计合成3组靶向敲除α-ENaC基因第一外显子的导向RNA,将3组片段分别克隆到CRISPR/Cas9表达载体骨架中。同时设计构建3组相应的含有靶位点的SSA-RPG阳性克隆筛选报告载体,作为游离于细胞基因组的靶位点模拟系统,对细胞阳性率进行评估并通过报告载体上嘌呤霉素抗性基因的修复进行阳性细胞筛选。使用Lipofectamine~TMM 2000 Reagent分别将3组α-ENaC/Cas9表达载体和相应的RPG/α-ENaC双荧光报告载体共转染至3组HEK293T细胞中,通过流式细胞术筛选出切割效率最高的一组α-ENaC/Cas9表达载体和RPG/α-ENaC报告载体。2.使用Lipofectamine~TMM 2000 Reagent将此组α-ENaC/Cas9表达载体和相应的RPG/α-ENaC双荧光报告载体共转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞细胞,转染后48 h,加3μg/mL嘌呤霉素筛选5天,获得单克隆细胞株。通过Western Blot检测嘌呤霉素筛选的阳性细胞株α-ENaC蛋白的表达水平,进一步通过测序验证获得的单克隆细胞株是否为基因敲除的突变细胞株。3.采用CCK-8法和EdU染色法检测突变细胞株的增殖能力,采用划痕试验检测突变细胞株的迁移能力。4.利用转录组测序检测α-ENaC基因敲除对L2细胞系基因表达谱的影响。结果1.成功构建了3组靶向α-ENaC基因第一外显子的α-ENaC/Cas9表达载体和相应的RPG/α-ENaC报告载体,通过在HEK293T细胞上检测三组CRISPR/Cas9系统活性,最终选择活性较高的α-ENaC-3/Cas9表达载体和相应的RPG/α-ENaC-3报告载体转染L2细胞。2.经嘌呤霉素筛选出8个单细胞克隆。Western Blot结果显示,筛选出的8个单细胞克隆,2个单细胞克隆的α-ENaC蛋白表达水平显著降低,1个单细胞克隆α-ENaC蛋白完全没有表达。测序结果表明,α-ENaC蛋白表达水平显著降低的2个单细胞克隆为单等位基因突变的细胞株,α-ENaC蛋白完全没有表达的1个单细胞克隆为双等位基因突变的细胞株。3.CCK-8试验以及EdU细胞增殖试验结果显示,突变细胞株的增殖能力显著降低(P<0.05),其中双等位基因突变细胞株的增殖能力显著低于单等位基因突变细胞株(P<0.05)。划痕试验结果显示,突变细胞株的迁移能力显著降低(P<0.05),其中双等位基因突变细胞株的迁移能力显著低于单等位基因突变细胞株(P<0.05)。4.双等位基因突变细胞株和野生细胞株的转录组测序结果显示,α-ENaC基因敲除后,共514个基因表达发生变化,其中168个基因表达上调,346个基因表达下调。功能分析表明,差异基因通过细胞因子-细胞因子受体互作、系统性红斑狼疮、ECM受体互作、神经配体-受体互作等信号通路影响炎症反应、细胞黏附、信号转导、细胞分化和细胞增殖等生物过程。进一步分析表明,Cxcl1、Cxcl12、Tlr2、Tlr4、Il33、Bmp6和Mmp9等基因可能在α-ENaC基因介导的细胞增殖和迁移过程中起到关键作用。结论本研究成功构建了α-ENaC基因敲除的稳定大鼠L2细胞系。α-ENaC基因敲除明显抑制大鼠L2细胞系的增殖能力和迁移能力。α-ENaC基因敲除导致的差异表达基因主要涉及炎症反应、细胞黏附、信号转导、细胞分化和细胞增殖等生物过程,影响细胞因子-细胞因子受体互作、系统性红斑狼疮、ECM受体互作、神经配体-受体互作等信号通路。