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选题依据:军团菌病(Legionellosis)是一种急性呼吸道传染病,主要症状是非典型肺炎。军团菌(Legionella)是引起军团菌病的病原体。临床上对军团菌病的治疗药物主要为大环内酯类和氟喹诺酮类抗生素,也用利福平予以辅助性治疗。细菌产生耐药性会导致临床感染治疗困难,给患者带来直接威胁,甚至使人类面临严重感染时将走到无药可治的境地。目前国内外鲜有嗜肺军团菌对抗生素表现耐药性的报导,因此对中国军团菌抗生素敏感性检测和深入研究菌株耐药机制有着重要意义。研究目的:本研究通过检测军团菌对红霉素、阿奇霉素、莫西沙星、左氧氟沙星和利福平的药物敏感性来研究军团菌的耐药谱;并进一步探究耐阿奇霉素军团菌的耐药机制、探究军团菌的耐药性与基于序列分型(Sequence-based typing,SBT)型别的关系和军团菌的耐药性与致病性的关系。为预防军团菌病暴发和临床合理用药、有效治疗军团菌病提供指导。研究方法:1.利用E-test法检测149株来自临床和环境的血清型1型嗜肺军团菌对红霉素、阿奇霉素、莫西沙星、左氧氟沙星和利福平的药物敏感性。2.利用PCR扩增并测序编码23S核糖体基因rrl、编码L4和L22核糖体蛋白基因rplD和rplV,与野生型国际参考菌株ATCC 33152基因型进行比对是否有耐药位点突变;利用PCR扩增编码甲基化酶基因ermA、ermB、ermC和ermF,扩增编码钝化酶基因ereA、ereB、mphA和mphB,扩增编码外排泵基因mefA/E和lpeAB,检测军团菌对阿奇霉素的耐药机制。利用SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR法测定耐药菌株相对于非耐药菌株lpeAB外排泵的表达水平;以羰基氰化物间氯苯腙作为外排泵抑制剂检测耐药菌株在外排泵抑制剂影响下最小抑制浓度的变化。3.利用PCR扩增并测序25株耐阿奇霉素军团菌flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA、neuA 7个管家基因,对军团菌进行SBT分型,与国际耐药菌株进行对比。4.利用耐药军团菌感染小鼠巨噬细胞J774细胞系,收集细胞及感染液后混匀,梯度稀释后选择三个浓度涂布于BCYE培养基,培养箱培养五天后进行菌落计数,对耐药菌株进行致病性研究。研究结果:1.149株血清型1型嗜肺军团菌对红霉素、莫西沙星、左氧氟沙星和利福平均表现敏感,MIC范围分别为0.064–1.0,0.064–0.38,0.19–0.75和0.002–0.023 mg/L。25株军团菌对阿奇霉素表现耐药性,耐药率为16.78%,MIC范围在1.5-2 mg/L。2.扩增并测序编码23S核糖体RNA结构域Ⅴ区基因rrl,未检测到基因发生突变;未检测到L4核糖体蛋白和L22核糖体蛋白氨基酸序列有耐药位点的突变;未检测到编码核糖体RNA甲基化修饰基因ermA、ermB、ermC和ermF;编码钝化酶基因ereA、ereB和mphA;编码mef外排泵基因mefA/E。检测到外排泵基因lpeAB,25株耐药菌株lpeAB基因表达水平均高于非耐药菌株;25株耐药菌株在外排泵抑制剂的环境中对阿奇霉素的MIC均小于无外排泵抑制剂环境时MIC的4倍及以上。3.耐药菌株型别有ST1、ST144、ST150、ST154和ST629五种,其中以ST1型为主。4.25株耐阿奇霉素军团菌中有24株菌有较强的细胞内生长能力,且15株细胞内生长能力强于参考菌株ATCC 33152。研究结论:149株血清型1型嗜肺军团菌对红霉素、莫西沙星、左氧氟沙星和利福平均表现敏感,25株军团菌对阿奇霉素表现耐药,lpeAB外排泵的表达赋予军团菌对阿奇霉素的耐药性;耐药菌株的SBT型别除ST1已有报导外,ST144、ST150、ST154、ST629均为国际首次报导。有15株耐药菌株表现高耐药性高致病性的特点。本研究的结果提示应加强我国军团菌的流行监测和对阿奇霉素的药物敏感性监测。