论文部分内容阅读
目的:通过体内外实验探讨片仔癀（Pien Tze Huang,PZH）对大肠癌淋巴管生成及Lnc RNA ANRIL/VEGF-C/PI3K/AKT通路的影响,阐明PZH防治大肠癌转移的作用机制,并为其临床应用提供新的实验依据。方法:体内实验:1.皮下移植瘤模型:采用HCT-116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,根据瘤体体积将裸鼠随机分成对照组与PZH组,PZH组按0.25 g/kg/天进行灌胃给药,对照组按照等体积的生理盐水灌胃,隔天测量瘤体体积和体重,连续给药2周后处死裸鼠,剥离瘤体并称重。免疫组化（IHC）检测瘤体组织LYVE-1、VEGF-C和VEGFR-3的表达;Western Blot（WB）检测瘤体组织VEGF-C、VEGFR-3蛋白表达;ELISA检测血清中VEGF-C的含量;RT-q PCR检测瘤体组织Lnc RNA ANRIL表达。2.原位移植瘤模型:采用HCT-116/luc细胞构建裸鼠原位移植瘤模型,分组和给药同皮下移植瘤模型。小动物活体成像观察瘤体的生长和转移情况;IHC、ELISA和RT-q PCR实验检测指标同皮下移植瘤模型;HE检测原位移植瘤的肝转移情况。体外实验:1.RT-q PCR检测不同大肠癌细胞株Lnc RNA ANRIL的表达:采用质粒和慢病毒分别构建HCT-116/si ANRIL细胞和HCT-8/ANRIL细胞;运用倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测细胞活力;Transwell实验观察细胞的迁移和侵袭能力;WB检测VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达。2.收集HCT-116/si ANRIL和HCT-8/ANRIL的细胞培养上清液干预HLEC,分别采用倒置显微镜、CCK-8、Transwell和管腔形成实验检测Lnc RNA ANRIL对HLEC淋巴管生成的影响。3.不同浓度的PZH干预HCT-8/ANRIL细胞,倒置显微镜观察细胞形态;MTT检测细胞活力;ELISA检测VEGF-C的含量。4.收集HCT-8/ANRIL及PZH（0.25mg/m L）处理后的细胞培养上清液培养HLEC,倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测细胞活力;Transwell实验观察细胞的迁移和侵袭能力;管腔形成实验观察淋巴管生成能力;WB检测MMP-1/-2/-7/-9、VEGFR-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白表达。结果:体内实验:1.皮下移植瘤模型:PZH可抑制瘤体体积和重量（P<0.05）,但对裸鼠体重无影响;PZH显著抑制瘤组织LYVE-1、VEGF-C和VEGFR-3的表达（P<0.05）、裸鼠血清中VEGF-C的含量（P<0.05）及Lnc RNA ANRIL的基因表达（P<0.05）。2.原位移植瘤模型:与对照组相比,PZH组的瘤体荧光强度明显较弱;PZH显著抑制瘤组织LYVE-1、VEGF-C和VEGFR-3的表达（P<0.05）、裸鼠血清中VEGF-C的含量（P<0.05）及Lnc RNA ANRIL的基因表达（P<0.05）;对照组的肝细胞有明显坏死和炎症细胞浸润,肝小叶结构混乱,肝细胞排列不整齐,而PZH组的肝细胞无水肿及坏死,肝小叶结构正常、分界明显,肝细胞排列整齐,未见炎症细胞浸润。体外实验:1.Lnc RNA ANRIL在HT-29细胞和HCT-116细胞中表达最高（P<0.05）,而在HCT-8细胞中的表达最低;HCT-116/si ANRIL组Lnc RNA ANRIL表达显著低于HCT-116/si NC组（P<0.05）;HCT-8/ANRIL组的Lnc RNA ANRIL表达显著高于HCT-8/NC（P<0.05）。Lnc RNA ANRIL沉默和过表达分别抑制和促进细胞增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05）。Lnc RNA ANRIL沉默和过表达分别下调和上调VEGF-C蛋白表达（P<0.05）。2.HCT-116/si ANRIL组HLEC细胞密度、活力、迁移、侵袭和管腔形成能力显著低于HCT-116/si NC组;HCT-8/ANRIL组HLEC细胞密度、活力、迁移、侵袭和管腔形成能力显著高于HCT-8/NC组（P<0.05）。3.PZH可降低HCT-8/ANRIL细胞密度、活力和VEGF-C分泌蛋白表达（P<0.05）,其中PZH 0.25 mg/m L浓度对HCT-8/ANRIL细胞形态和细胞活力未见显著影响。4.HCT-8/ANRIL组HLEC细胞活力、迁移和侵袭能力显著高于HCT-8/NC组（P<0.05）,而HCT-8/ANRIL+PZH和HCT-8/NC+PZH组的HLEC细胞迁移和侵袭能力则显著降低（P<0.05）,且HCT-8/ANRIL+PZH组的HLEC细胞活力、迁移和侵袭能力高于HCT-8/NC+PZH组（P<0.05）。管腔实验结果与迁移和侵袭结果趋势一致;与HCT-8/NC组相比HCT-8/ANRIL组MMP-1/-2/-7/-9、VEGFR-3、p-PI3K和p-AKT蛋白表达上调（P<0.05）,HCT-8/NC+PZH组、HCT-8/ANRIL+PZH组分别与HCT-8/NC、HCT-8/ANRIL组相比上述蛋白表达呈下降趋势（P<0.05）。结论:Lnc RNA ANRIL是PZH抑制大肠癌淋巴管生成的重要靶标之一。PZH可通过靶向Lnc RNA ANRIL/VEGF-C/PI3K/AKT通路,从而发挥其抑制大肠癌淋巴管生成的作用和达到抑制大肠癌转移和治疗大肠癌的目的。