【背景】世界卫生组织统计,每年全球因流感而感染的约10亿人,死亡的人数约达30至50万[1]。流感有4型,分别是甲型流感、乙型流感、丙型流感和丁型流感（2011年发现）,其中甲型流感致病性和传染性最强,致死率最高;目前治疗流感病毒的方法有接种流感疫苗和抗病毒药物的应用（包括中医药抗流感病毒）。而由于流感病毒为RNA病毒,具有很强的突变能力,容易导致抗原漂移和抗原转变,使得疫苗失效、病毒对抗流感药物出现耐药。所以需要筛选更多的药物,比如中药,以应对未来可能再一次出现的流感大流行。目前筛药的方法常见的有MTT法,但此方法可重复性低,实验步骤繁琐,耗时长,所以需要可用于大量筛药的更直接高效的方法替代。本课题运用反向遗传学,制备携带m Cherry基因的甲型流感病毒,可为抗流感中药的筛选提供有力的工具。流感在中医上可认为是疫病。在古代,对疫病的治疗,中医中药发挥着及其重要的作用;而去年的新型冠状病毒,对中医中药的运用,更是大大降低了死亡率。蔓荆子,为马鞭草科植物蔓荆的干燥成熟果实,有疏散风热,清利头目的功效,为中医感冒方剂中的常用药物。但鲜少有文献对其抗病毒作用进行研究,本文选取蔓荆子的水提物,验证其对新甲流是否有抗病毒作用。【目的】（一）运用反向遗传学构建新甲流H1N1携带m Cherry红色荧光报告基因的重组流感毒株;通过BABL/C小鼠传代产生新甲流H1N1老鼠适应毒株以及构建携带m Cherry基因的老鼠适应毒株。（二）通过核酸、蛋白、荧光的方法验证携带m Cherry基因的重组H1N1病毒是否能稳定存在且成功表达红色荧光。再从聚合酶活性、动物致病性两个方面探究该重组病毒的特性。（三）初步探索中药蔓荆子水提物是否有抗流感病毒的作用。【方法】（一）利用反向遗传学构建PA-m Cherry质粒,拯救携带m Cherry基因的新甲流H1N1重组流感病毒,同样的方法拯救H1N1老鼠适应性毒株及其携带m Cherry基因的重组病毒。（二）运用PCR、蛋白印迹实验、间接免疫荧光等实验方法验证重组流感病毒的基因稳定性和报告基因的表达;评估病毒在体外复制的生长动力学,荧光素酶报告测定聚合酶活性以及测定病毒对小鼠的半数致死量(MLD50),探究病毒的特性。（三）用噻唑蓝染色法（MTT法）、子代病毒产量减少法探究中药蔓荆子水提物对甲型流感病毒H1N1的抗病毒作用。运用携带m Cherry基因的重组H1N1病毒作为筛药的工具,通过荧光法初步探究蔓荆子水提物的抗病毒作用。【结果】（一）携带m Cherry基因的重组H1N1病毒的构建利用反向遗传学方法在A/Guangdong/GLW/2018（H1N1）（GLW-WT）病毒的PA基因片段中找到合适的包装信号位点,将m Cherry基因插入PA基因中,成功制备出携带红色荧光基因、表达红色荧光蛋白并具有复制传代能力的甲型重组流感病毒（GLW-WT-m Cherry）。接着,将GLW-WT病毒在小鼠中进行适应性传代,分离纯化出对小鼠有致病性的病毒GLW-MA;将m Cherry基因插入GLW-MA病毒的PA基因后,成功拯救携带红色荧光基因、表达红色荧光蛋白的小鼠适应性重组流感病毒（GLW-WT-m Cherry）。这为抗病毒药物的体外和体内筛选提供了强有力的工具。（二）病毒特性的研究运用病毒体外复制的生长动力学,PCR,蛋白质印迹,间接免疫荧光等方法证明携带m Cherry基因的重组H1N1病毒能够容纳完整的PA-m Cherry基因,并且在MDCK细胞中成功表达红色荧光蛋白。通过对GLW-MA病毒基因测序,与GLW-WT病毒基因序列进行比对,新甲流病毒的老鼠适应毒株GLW-MA产生基因突变,通过荧光素酶报告检测证明PA I61M、E351K、G631S三个氨基酸突变位点能够增加聚合酶复合体的聚合酶活性。PA和HA的基因突变可能是GLW-MA病毒产生小鼠适应性的分子因素。GLW-WT（H1N1）病毒对小鼠没有致病性,GLW-MA毒株和GLW-MA-m Cherry毒株对小鼠均有致病性。（三）探究蔓荆子水提物的抗病毒作用通过MTT法测得蔓荆子水提物对GLW-WT病毒的体外IC50值为7.78±1.21μg/m L;通过子代病毒产量减少法表明,随着药物浓度的升高,子代病毒产量逐渐减少。运用GLW-WT-m Cherry病毒作为筛药工具,运用荧光法证明蔓荆子水提物对GLW-WT-m Cherry病毒的作用;结果表明,随着药物浓度的增大,GLW-WT-m Cherry病毒在MDCK细胞中的荧光表达越来越少。初步证明蔓荆子水提物具有抗病毒作用。【结论】利用反向遗传学成功构建携带m Cherry基因的重组流感病毒GLW-MA-m Cherry和GLW-WT-m Cherry。运用携带m Cherry基因的重组流感病毒GLW-WT-m Cherry作为筛药工具,初步证明蔓荆子水提物具有抗流感病毒的作用。