目的：构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)中ATP依赖的酪氨酸蛋白酶蛋白水解亚基(ATP-dependent caseinolytic proteaseproteolytic subunit,ClpP1)的原核表达质粒，转入E.coli中诱导表达和纯化ClpP1重组蛋白，并通过应激试验探讨ClpP1重组蛋白的生物学特性；将纯化的ClpP1重组蛋白免疫白兔制备相应的多克隆抗体，间接ELISA法分析制备抗体的的抗原反应性，并初步评价其应用价值。方法：1.以Mtb(H37Rv)基因组为模板，用PCR法扩增ClpP1片段,将其定向插入至pET32a(+)载体上，构建ClpP1重组质粒,并用双酶切和DNA测序进行验证。2.将构建成功的ClpP1重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，IPTG诱导表达ClpP1重组蛋白；经Western-blot鉴定蛋白后，采用亲和层析法纯化目的蛋白。3.通过研究ClpP1重组蛋白对宿主菌的生长、耐高温、抗氧化及生物膜形成等影响的应激试验和以纯化ClpP1重组蛋白为抗原的间接ELISA法一起探讨ClpP1重组蛋白的特性。*本课题由国家青年科学基金（81101216）资助4.用纯化ClpP1重组蛋白免疫新西兰白兔，制备ClpP1多克隆抗体及检测其效价，并用BCG中ClpP1蛋白进一步检测多克隆抗体的特异性。5.通过间接ELISA法，用制备的ClpP1多克隆抗体检测结核病(tuberculosis, TB)、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺气肿(Chronic obstructivepulmonary disease, COPD)和肺癌患者血清中ClpP1抗原的水平，计算其检测的敏感性和特异性。结果：1.重组质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切鉴定后，片段大小与理论值相符，测序结果与在Gene Bank中查找的序列一致。2.重组蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在约35kDa处出现特异性条带；通过亲和层析法分离和纯化ClpP1重组蛋白后，BandScan软件分析得出重组蛋白表达量约占总菌体蛋白的33%，且纯化蛋白的浓度和纯度分别为1.1mg/ml和93%。3.通过应激试验得出ClpP1重组蛋白具有促进生长和帮助提高宿主菌对高温及过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)耐受能力的作用，而对生物膜的形成并未有促进作用；ClpP1重组蛋白检测结核病病人和健康人血清中的ClpP1抗体水平的实验结果表明实验组与对照组间具有显著性差异。4.用纯化ClpP1重组蛋白免疫新西兰白兔4次后，检测其抗体效价为1:640000；Western-blot结果显示制备的抗体可较好地与BCG中ClpP1蛋白发生特异性结合。5.用制备的ClpP1多克隆抗体检测结核病、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺气肿和肺癌患者血清中ClpP1抗原水平的实验结果显示结核病组与其他疾病组间差异显著，且检测的敏感性和特异性分别为69.9%和89.3%。结论：1.成功构建了ClpP1重组表达载体，并诱导及纯化得到具有免疫原性的ClpP1重组蛋白。2. ClpP1重组蛋白具有促进生长、帮助提高宿主菌抵抗高温和H2O2的耐受能力及具有良好的抗原性等特点，但没有促进宿主菌的生物膜形成的作用。3.制备了具有较高效价，良好特异性及抗原反应性的ClpP1多克隆抗体，在结核病血清学快速诊断方面具有较好的应用前景。