论文部分内容阅读
花是高等植物的主要生殖器官,对高等植物繁衍生息有着重要意义。FcSEP1基因是SEPALLATA(SEP)基因家族中一个重要基因,研究发现SE5类基因主要参与调控高等植物花、果实发育过程以及影响植物的开花时间。目前已经在苹果、桃、樱桃、芒果、葡萄、枣树等多种果树中克隆得到其同源基因。而金柑在适宜的条件下一年可多次开花、结果,花果同树,其独特的开花特性与其它果树有所差异,其成花的分子机制尚不清楚,且FcSEP1基因在柑橘类果树中也罕有研究。为了探明金柑FcSEP1基因的功能,本研究以融安滑皮金柑为实验材料,首先通过在金柑转录组测序数据分析的基础上获得的FcSEP1同源基因片段序列信息,采用同源基因克隆方法,成功克隆出FcSEP1同源基因cDNA全长,分析其生物信息学特点;其次利用实时荧光定量实验对FcSEP1基因在金柑不同组织和时间上的表达特性进行了分析;然后利用SMART及同源重组技术构建金柑花蕾cDNA文库,并通过酵母双杂交技术筛选获得了一个与FcSEP1蛋白互作的蛋白;同时又构建了真核表达载体pBI121-FcSEP1,通过根癌农杆菌介导的方法进行遗传转化研究,并获阳性拟南芥植株与金柑遗传转化抗性芽,初步验证FcSEP1基因的功能。本研究为探明金柑FcSEP1基因参与的成花的分子机制奠定了坚实的理论基础。主要结果如下:(1)通过生物信息学分析表明FcSEP1基因的cDAN序列为750bp,编码250个氨基酸,其编码蛋白质理论分子量为:28415.58,理论等电点值为:8.74,原子个数为4010,分子式为:C1256H2013N359 0 372S10,不稳定指数(Instabilityindex)为52.12,在酵母活体细胞中半衰期大于20h,在大肠杆菌活体细胞中大于10h,蛋白质总平均亲水性值为-0.491;其氨基酸序列上无信号肽结构、无糖基化位点、但存在多个磷酸化位点,预测其为不稳定的亲水蛋白。其二级结构分析显示,α-螺旋结构均匀地排布在蛋白整个多肽链中;β-转角和折叠延伸结构数量较少,但主要分布在多肽链的两端;从整体来看,无规卷曲镶嵌在整个多肽链中;亚细胞定位预测其为核蛋白。利用MEGA7.0软件对FcSEP1编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、甜橙、桃、李、樱桃、番荔枝、杏、猕猴桃、金丝小枣、核桃、榴莲等的SEP类基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现这些氨基酸序列除了信号区外,其功能区域同源性较高,这表明SEP类基因编码的氨基酸在功能上是相似的。(2)通过实时荧光定量实验分析发现:FcSEP1基因主要在花器官和幼果中表达,而前期主要在花器官中的表达量最大,随着时间推移FcSEP1起初在直径为0.4cm的幼果中表达量较高,慢慢地在直径为0.6cm、0.8cm、1.0cm的幼果中也有所表达,在茎中有少量表达,而在叶片中无论是嫩叶还是老叶几乎没有表达。可以推测FcSEP1基因可能参与金柑花发育和果实的生长发育过程。(3)通过SMART及同源重组技术构建了金柑花蕾cDNA文库,其文库滴度为2.83×108 cfu/mL,文库库容为1.42×1010cfu,重组率为97.91%,插入的双链cDNA片段长度主要分布在250～2000bp之间。(4)利用酵母双杂交技术筛选了金柑花蕾cDNA文库中与FcSEP1蛋白相互作用的蛋白。经鉴定、测序分析该互作的阳性蛋白,其为乙醇脱氢酶(ADH1),通过酵母体内回转实验进一步验证了 FcSEP1蛋白与乙醇脱氢酶(ADH1)是真实互作;前人研究表明,乙醇脱氢酶(ADH1)在植物生长发育和果实生长及成熟过程中起着重要作用,结合前人的研究可推测FcSEP1蛋白可能参与调控金柑生长发育和果实的生长及成熟。(5)成功构建金柑FcSEP1基因的真核表达载体pBI121-FcSEP1,利用花序浸染法介导转化拟南芥,收获转基因植株的T0代种子。同时利用根癌农杆菌介导法转化金柑黄化苗上胚轴,获得了 89个抗性芽,抗性芽再生率为19.39%。