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目的:应用含补肾中药血清研究补肾方对人胚胎干细胞体外分化为类卵泡结构的研究。方法:以H9人胚胎干细胞为实验对象,诱导H9细胞形成拟胚体(EB),加入含22、23、24、25、26、27#方的含药血清,血清浓度为3%;另以分化诱导因子骨形成蛋白4(BMP4)作为阳性对照,BMP4终浓度为100pg/ml;以不加BMP4的完全培养液作为空白对照。显微镜动态观察H9拟胚体生长和分化的形态学变化;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测EB和分化细胞生殖分化标志基因的表达;采用免疫荧光技术检测生殖细胞分化相关的标志蛋白表达;应用酶联免疫(ELIS)A技术定量测定了分化后期培养液中E2含量。实验产生的数据均使用SPSS19.0统计学软件处理,若同时满足正态分布和方差齐性,则取用x±s表示,运用单因素方法分析和配对T检验进行检测。结果:含补肾中药血清诱导H9拟胚体生长及分化1.1各含药血清组可明显促进EB的生长和诱导EB分化,在诱导分化第3天出现与阳性对照类似的早期分化特征:大量细胞从EB游离,EB逐渐缩小呈不规则形;同时收集EB及游离细胞检测胚胎干细胞分化标志基因Oct-4 mRNA的表达。结果显示:加入含药血清前其Oct-4基因大量表达,加入含药血清培养第3天,各组EBOct-4 mRNA明显下调,表明含补肾中药血清在短期内即启动EB分化。1.2进一步检测了与生殖发育相关的基因表达,各含药血清组对生殖分化相关基因的表达有明显差异,其中23#含药血清在诱导GDF9、ZP1和SCP3的表达均强于BMP4。进一步采用免疫荧光技术检测了 23#含药血清组诱导EB分化第5天GDF9的蛋白表达。与mRNA水平检测结果一致,阴性对照组因具有自发分化特性,GDF9有较弱表达;BMP4和23#含药血清诱导的GDF9表达明显增强,且23#含药血清优于BMP4。2.含补肾中药血清诱导人胚胎干细胞向生殖特异性组织细胞分化2.1含药血清诱导分化5-7天,BMP-4阳性对照组和23、25、26#含药血清组均可观察到一类明显大于其它分化类型的细胞,该类该细胞直径大于50μm,形态酷似类卵细胞。继续延长培养分化时间至7-10天,类卵细胞直径增加,其边缘逐渐形成细小颗粒;诱导分化至11-16天,类卵细胞边缘的颗粒层随时间延长而增厚,胞体直径均大于100μm,某些颗粒层呈现扁平状结构。推定这类被颗粒细胞层包裹的细胞为类卵泡结构(follicle-like structures,FLSs)。为了证实含药血清诱导分化的类卵泡结构,选择23#含药血清诱导分化并持续16天,在显微镜下观察和记录了 FLSs形成的动态变化。综合分析结果显示,含药血清以及BMP4可在5-16天内,诱导H9胚胎干细胞形成至少3种FLSs结构,包括从始基卵泡(primordial follicles)→初级卵泡(primary follicles)→次级卵泡(secondaryfollicles)的发育。2.2补肾中药诱导分化类卵泡形成的分子标志物鉴定2.2.1原始卵泡期的分子标志物分析为了进一步证实类卵泡结构的形成,选择23#含药血清,培养H9细胞3-7天,在原始卵泡形成数量较多时,应用RT-qPCR技术检测原始卵泡形成过程中3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清在诱导分化3、5、7天,均上调GDF9和SCP3的表达,呈现时间依赖性;23#含药血清也诱导VASA表达,但在分化第7天表达下调。GDF9和SCP3表达的时间依赖性与原始卵泡在体外分化发育的时间基本一致;VASA基因在诱导分化第7天表达下调,提示VASA的表达与始基卵泡发育有关。另选择23#含药血清诱导培养第7天的原始卵泡,检测了GDF9的蛋白表达,与基因表达水平一致,在单个类卵泡结构中显示较强的荧光信号。2.2.2生长卵泡期的分子标志物分析另收集培养7-16天的分化细胞,检测了生长卵泡形成期间3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清诱导分化7、9、11天,均上调ZP1、ZP2和ZP3表达,并呈现时间依赖性。对23#含药血清诱导培养第11天的生长卵泡,检测了ZP1的蛋白表达,结果显示在单个生长卵泡结构的颗粒层与卵母细胞之间有较强的荧光信号。2.3补肾中药诱导的卵母细胞发育的形态学特征原始卵泡和生长卵泡期的卵母细胞为初级卵母细胞,具有减数分裂Ⅰ各期特征,为了证实含药血清诱导的初级卵母细胞形成的减数分裂Ⅰ特征,采用免疫荧光技术,应用β-actin染色细胞骨架,Hoechst33258染色减数分裂各期的核结构,以此鉴定被颗粒层包裹的类卵母细胞。结果显示,23#血清诱导分化7-16天的类卵细胞包括有卵原细胞和处于细线期、偶线期、粗线期的初级卵母细胞;在含药血清诱导分化过程中偶见处于双线期的卵母细胞。这从减数分裂前各期的形态学特征进一步证实了补肾中药可诱导类卵泡结构形成。2.4补肾中药诱导分化形成的前颗粒细胞分子标志物及功能评价2.4.1前颗粒细胞分子标志物分析收集诱导第11天的分化细胞,检测了颗粒细胞标志物FSHrmRNA的表达,其中23#含药血清组FSHrmRNA表达明显高于BMP4阳性对照。特针对23#含药血清诱导培养第11天的生长卵泡,检测了 Aromatase的蛋白表达,结果显示在单个生长卵泡结构外缘的颗粒层有较强的荧光信号。2.4.2前颗粒细胞功能评价向各组培养液中添加终浓度为50ng/ml的睾酮,收集诱导分化第9和11天的培养液,检测培养液中E2的表达情况:在诱导分化第9天,23#含药血清组其培养上清中的E2浓度显著高于阴性对照组,略低于BMP4组;在诱导分化第11天,23#含药血清组其培养上清中的E2浓度明显增加,显著高于BMP4组。在诱导分化第11天,向各组培养液中加入终浓度为0.1IU/mL的FSH,培养48h后,各组培养液中E2浓度均较添加FSH之前明显升高,23#含药血清组中E2浓度显著高于BMP4组,提示BMP4和23#含药血清诱导分化的类卵泡结果具有一定的功能。结论:1.本研究培养的EB处于未分化状态,且具有多能性;含补肾中药的血清可明显促进EB生长,并在短期内启动分化程序,表明补肾中药具有快速诱导人胚胎干细胞体外分化的能力。2.含补肾中药血清可促进人胚胎干细胞体外分化为类卵泡结构,包括由始基卵泡→初级卵泡→次级卵泡的发育,但在本实验条件下,未观察到成熟卵泡的形成。表明含药血清可诱导人胚胎干细胞形成类卵泡结构,但FLSs的发育停留在窦前卵泡阶段。3.诱导分化的类卵泡结构中的卵母细胞具有减数分裂Ⅰ的形态特征,包括卵原细胞和处于细线期、偶线期、粗线期的初级卵母细胞。4.诱导分化的类卵泡结构中逐渐生成的前颗粒细胞具有合成雌激素的功能,对FSH有明显反应。综上,通过含补肾中药血清体外诱导人胚干细胞分化的研究为表明,补肾中药具有诱导人胚干细胞分化为类卵泡结构,具有合成雌激素的功能。本研究应用人胚胎干细胞成功诱导分化为类卵泡结构为首次报道,为人胚干细胞的生殖细胞定向分化以及补肾中药诱导类卵泡结构的深入研究分化作用奠定了良好基础。