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目的：人停滞缺陷蛋白1(human arrest defective1, hARD1)是一种N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase, NAT),发挥蛋白质N-a-乙酰基催化功能；hARD1在人类某些肿瘤及其他疾病研究中,从基因至蛋白水平的研究均有所涉及,近年来逐渐成为研究的热点。本研究探讨重组质粒hARD1-shRNA对人大肠腺癌裸鼠移植瘤生长状况及组织细胞凋亡的影响,从而为靶向分子治疗大肠癌提供实验基础和理论依据。方法：1、人大肠腺癌细胞SW620的培养。2、重组质粒的构建及鉴定：构建1rARDl干扰质粒(pENTRTM/U6-hARD1-shRNA),测序鉴定质粒是否构建成功。3、细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选及鉴定：利用脂质体LiofectamneTM2000将成功构建的pENTRTM/U6-hARDl-shRNA及无关序列质粒pENTRTM/U6-NC分别转染SW620细胞。G418筛选培养基中具有抗性的单细胞来源的细胞克隆,扩大培养。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为实验组,无关序列质粒整合的细胞克隆为阴性对照组,未转染的细胞为空白组；采用倒置荧光显微镜观察细胞稳定转染情况。4、人大肠腺癌裸鼠移植瘤模型的构建：将裸鼠随机分为3组,每组10只,以右侧肩胛下为注射点,三组分别为：皮下注射稳定表达pENTRTM/U6-hARDl-shRNA的SW620细胞为实验组,皮下注射稳定表达pEN TRTM/U6-NC的SW620细胞为阴性对照组,皮下注射未转染的SW620细胞为空白组,饲养并观察三组移植瘤生长状况。5、采用HE染色光镜观察各组裸鼠皮下移植瘤及各脏器组织形态学的变化。6、采用Western blot;方法检测各组瘤组织rARD1蛋白水平的表达情况。7、采用qRT-PC技术检测各组瘤组织hARD1mRNA水平的表达情况。8、采用TUN EL法对各组瘤组织的凋亡状况进行检测。9、采用透射电镜技术观察大肠腺癌裸鼠移植瘤细胞超微结构及凋亡情况。10、统计学处理：应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,资料用均数士标准差(x±S)表示；两组均数的比较用t检验；多组均数的比较用方差分析；方差不齐时先进行变量转换。显著性水准α=0.05。结果：1、人大肠腺癌细胞SW620体外培养成功且生长状态良好。2、成功构建了pENTRTM/U6-hARDl-shRN重组质粒,测序正确。并成功转染人大肠腺癌细胞SW620后,G418筛选出稳定转染细胞系,倒置荧光显微镜检测实验组与阴性对照组转染效率均大于97%。3、hARD1-shRNA对大肠腺癌裸鼠移植瘤生长状况的影响30只裸鼠皮下移植瘤生长明显,成瘤率为100%；分别在接种后每3d进行裸鼠瘤体体积测量,连续25d测量3组裸鼠的成瘤体积,绘制体积生长曲线,于第25d后采用颈椎脱臼法处死裸鼠,取瘤称重；发现实验组瘤体体积及重量明显小于空白组和阴性对照组。结果：实验组与对照组两两相比裸鼠移植瘤体积及重量差异具有统计学意义(P<0.05)；空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。4、裸鼠移植瘤病理组织形态学改变经HE染色后,各组大肠腺癌裸鼠移植瘤组织在光镜下可见大小不等形态不一的瘤细胞团,其间可见散在的小片状或灶状坏死,在裸鼠移植瘤的瘤细胞团内可见到由少量纤维结缔组织成分构成的间质。大肠腺癌裸鼠移植瘤细胞大小不等、多呈圆形、细胞核深染、核仁可见,异型性明显,病理性核分裂像可见。三组裸鼠各脏器HE染色病理形态学变化均为正常形态变化。5、Western blot法检测各组裸鼠移植瘤组织中hARD1蛋白水平表达情况对三组移植瘤组织中hARD1蛋白相对表达量进行灰度值分析,结果表明：实验组与对照组两两对比差异有统计学意义(P<0.05)；空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。6、qRT-PCI检测各组瘤组织hARD1mRNA水平的表达情况提取三组移植瘤细胞总RNA,设计合成引物,以GAPDH为内参基因,进行qRT-PC检测,对hARD1mRNA进行均一化处理,利用2-△△t法进行计算hARD1mRNA的相对表达量,结果表明：实验组与对照组两两对比差异有统计学意义(P<0.05)；空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。7、TUNEL检测各组移植瘤组织细胞凋亡的情况用TUNEL法检测各组移植瘤组织细胞凋亡,实验组中的可见细胞核呈紫蓝色颗粒沉着的阳性细胞(凋亡细胞)；而两对照组细胞核呈淡红色为阴性细胞,且未发现阳性细胞。实验组与两对照组相比凋亡率明显增加。8、透射电镜观察各组移植瘤细胞凋亡的情况利用透射电镜观察三组移植瘤组织细胞的凋亡情况,发现在移植瘤组织中,肿瘤组织细胞核大而不规则,核仁增大,形状不规则,核仁可紧贴核膜,常染色质丰富：细胞器较少,线粒体数量减少,能见到少量粗面内质网,核分裂像常见,细胞核质比增大,为典型恶性肿瘤细胞的形态特征。实验组可见胞质固缩、细胞体积变小、胞质电子致密度增高,染色质固缩并凝结成形态不同的块状,聚集于核内不同部位,呈现早期凋亡细胞形态；部分细胞核裂解,产生数量不等体积不同的凋亡小体；空白组与阴性对照组中未见确切的凋亡细胞出现。结论：1、hARDl-shRNA可以下调大肠腺癌裸鼠移植瘤组织中的hARD1mRNA水平及蛋白水平的表达。2、hARD1-shRNA可以抑制大肠腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,为大肠癌的分子靶向治疗提供了可能的理论依据。3、hARD1-shRNA可以体内诱导大肠腺癌裸鼠移植瘤组织细胞凋亡,为进一步深入研究hARD1在大肠癌发生发展所起的作用提供了理论依据。