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研究背景心血管疾病是起病隐匿、病程较长,预后较差且发病率、死亡率高的慢性非传染性疾病,严重威胁人类的健康和生活质量。针对导致心血管疾病的可控原因开展一级预防是减少发病的主要措施。然而由于病因多样、发病机制复杂,在心血管病的防治研究中要不断深化和拓展心血管病的病因和发病机理的探索,从复杂的环境中寻找各个方面的致病因子,并依此提出预防措施。真菌毒素(mycotoxin)是由真菌产生、主要存在于粮食及其制品、动物饲料中的一大类代谢物。在粮食短缺时期由于摄入霉变粮食,曾造成严重的真菌毒素中毒事件。据联合国粮食及农业组织(FAO)估计,全球约有1/4-1/3的谷物受到真菌毒素的污染,饲料污染的情况则可能更为严重,是最危险的谷物天然污染物。近年来诸多研究证明真菌毒素与心血管疾病的发病有关,其中黄绿青霉素(citreoviridin, CIT)是真菌毒素中与心血管损伤关系最为密切的一种。以往研究发现CIT可抑制血管内皮的增殖,影响内皮细胞正常调节功能,影响粘附分子的表达和释放。由于血管内皮的损伤和由此引起的血管炎症性病变是动脉粥样硬化的始动因素,而动脉粥样硬化又是心血管疾病的病理基础,因此我们提出以下假设：CIT毒素可干扰内皮细胞的正常功能,引发血管内皮损伤,进而促进动脉粥样硬化的发病。基于此研究假设,本研究从体外细胞培养和体内的动物实验两个方面观察了CIT对血管内皮细胞粘附功能的影响,分析了CIT在动脉粥样硬化发病中的作用。药物与蛋白质等生物大分子的相互结合和结构变化,决定了药理或毒理作用的发生和发展,也影响到药物在人体内吸收和代谢。通过各种方法探讨药物与蛋白质等生物大分子的相互作用,有助于阐明药物生物学作用的机理。血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)、免疫球蛋白(Immunoglobulin, IgG)和溶菌酶(Lysozyme, LOM)在生物体内发挥了重要的功能,常被选为开展该类研究的蛋白质模型。因此,本研究采用荧光光谱(fluorescence spectroscopy, FS)、紫外光谱(ultraviolet spectroscopy, UVS)、红外光谱(infrared spectroscopy,IR)、圆二色谱(circular dichroism, CD)分析了CIT与HSA、IgG和LOM相互作用的机理,并采用分子模拟技术构建了CIT与三种蛋白质相互作用的分子模型。生态学研究(ecological study)是在群体水平探讨暴露因素与疾病之间联系的流行病学方法,通过比较不同地区、不同时间或不同人群之间在群体水平上暴露剂量的差异与疾病发病、患病或死亡水平的高低,分析暴露因素是否为疾病的潜在病因。该类研究具有过程简单、数据分析简便的优点,并能够快速得出研究结论。尽管生态学研究还有诸多方法学上的缺陷,比如无法评价个体水平上暴露因素与疾病之间的联系、容易产生生态学谬误等,但该方法在从宏观的角度去提出病因假设或提供证据方面还是具有独特的优势,尤其是对于暴露因素的暴露剂量无法准确定量的疾病,该方法提供了比较直接的研究途径。故本论文通过一项生态学研究,比较了冠心病发病水平不同的两个地区CIT毒素在粮食中的污染程度,分析冠心病与粮食中CIT污染之间的潜在联系。目的1.通过体外培养血管内皮细胞,观察CIT对肿瘤坏死因子a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)诱导的血管内皮细胞粘附功能的影响；2.通过动物实验观察CIT在动脉粥样硬化发病中对粥样斑块的形成和血管炎症反应的影响；3.采用光谱分析方法和分子对接模拟技术,分析CIT与三种生物大分子：人血清白蛋白、人免疫球蛋白和溶菌酶发生化学结合和相互作用的机理；4.通过生态学研究,比较在冠心病发病率不同的地区CIT污染的程度,分析冠心病与粮食中CIT污染之间的潜在联系。方法通过体外培养人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),分别用CIT、TNF-a和CIT+TNF-a三种染毒方式处理HUVECs.经药物作用6h后观察HUVECs与单核细胞的粘附作用强度；用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定内皮细胞释放的细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、E选择素(E-selectin);用蛋白免疫印迹法(Western blotting)法检测ICAM-1、VCAM-1和E-selectin三种蛋白在细胞内的表达水平；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定单核细胞趋化因子-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)在细胞内的转录水平；针对核转录因子κB (Nuclear Factor-kappa B, NF-κB)的活性亚基p65进行免疫荧光染色法,检测其由细胞质向细胞核内转移和激活情况；用蛋Western blotting法检测NF-κB p65亚基在细胞核内的含量。以“西方类型膳食”型高脂饲料(含有胆固醇0.150%,脂肪21%)饲养载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠,采用高剂量CIT (1.0mg/kg)和低剂量CIT (0.5mg/kg)染毒15周后测定相关实验指标。用生化分析仪测定TG、TC、HDL、LDL、VLDL等血脂指标；取小鼠整条主动脉标本和心脏标本,免疫组化法检测主动脉根部内皮VCAM-1、ICAM-1、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)的表达情况；ELISA法检测血清ET-1、VEGF含量；实时定量PCR(Real Time PCR)测定主动脉ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的转录水平；油红O染色法诊断主动脉中脂质斑块的形成情况。在实验室内模拟CIT与HSA、IgG、LOM进行化学结合和相互作用的过程,采用荧光光谱、红外光谱、圆二色性光谱、紫外光谱等方法分析CIT与生物大分子相互作用位点、测定作用力类型、分析结构变化和结合过程中的能量转移情况,用分子对接模拟技术绘制相互作用的分子模型。采用生态学研究的方法,在收集黑龙江省依安县和桦川县2008-2011年冠心病死亡数据,并采集大米、面粉、小米等粮食样品,测定粮食中CIT污染情况,分析比较CIT污染程度与冠心病发病水平之间的关联。结果1.CIT处理组HUVECs与单核细胞发生粘附作用的强度高于对照组,细胞上清液ICAM-1、VCAM-1和E选择素等粘附分子浓度高于对照组；CIT处理组细胞内ICAM-1、VCAM-1和E选择素等蛋白的表达量高于对照组；CIT处理组细胞NF-κB在细胞核内的表达量高于对照组。2.CIT处理组小鼠动脉粥样硬化斑块面积高于对照组,动脉内膜和斑块中ET-1、VEGF、VCAM-1、ICAM-1表达量高于对照组,小鼠血清VEGF、ET-1含量高于对照组。3.通过分析CIT与HSA、IgG和LOM的相互作用,计算结合常数和结合位点数,发现CIT与HSA结合的荧光猝灭机制为动态猝灭,与IgG结合的荧光猝灭机制为动态猝灭,与LOM的结合可增强荧光效应；CIT与HSA、IgG和LOM的结合位置距色氨酸残基的距离分别为3.25、3.32和3.61 nm,小于7 nm,结合过程发生了能量转移；由热力学参数的结果结合分子模拟研究,确定CIT与HSA间的作用力主要是疏水力和氢键,与IgG和LOM的作用力主要是疏水力和静电作用,并兼有氢键。4.2008-2011年依安县各年龄组冠心病死亡率均高于桦川县,依安县粮食中CIT毒素含量高于桦川县。结论1.CIT促进了TNF-α诱导的血管内皮细胞的粘附作用,该作用是通过增强内皮细胞NF-κB的核内易位,诱导相关基因转录,使得ICAM-1,VCAM-1,E选择素等粘附分子的表达增高。2.CIT增强了高脂饲养的ApoE-/-小鼠主动脉的炎症反应,加重了动脉粥样硬化的病变程度。3.CIT与HSA、IgG和LOM的结合过程发生了能量转移和二级结构的变化,本文分析确定了CIT与三种蛋白之间的作用力类型,获得了相互作用的参数指标。4.依安县和桦川县两地冠心病死亡率的差异可能与粮食的CIT污染程度有关联。