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大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产欧洲沿海的一种特有的名贵低温经济鱼类。耐高温性能是大菱鲆重要性状和遗传改良的主要目标,而通过QTL定位获得与耐高温性状紧密连锁的分子标记以及功能基因是分子遗传育种的重要工具。本实验室在丰富的遗传群体基础上,已完成高密度遗传连锁图谱的构建工作,本论文主要开展大菱鲆耐高温性状的QTL定位;并对定位区间进行全基因组比对及注释,筛选与耐温相关的候选基因;并对QTL区间内富集的P53信号通路中的相关基因在高温胁迫条件下的影响开展初步探究。本研究对于大菱鲆耐高温性状选育以及分子机理研究提供理论依据。具体内容如下:1.本研究在实验室已构建的高密度遗传连锁图谱基础上,开展耐高温性状QTL定位及区间内候选基因筛选。结果显示:共获得7个QTL区间与耐高温性状相关联,它们分别定位在LG17,LG17,LG17,LG20,LG21,LG4和LG6,其中LG17(0cM)具有最大LOD值(5.77),表型变异解释率达36.3%;而LG17(81.113 cM)具有最小LOD值(3.08),表型变异解释率21.4%。耐高温QTL区间,标记距离范围在1.75cM-25.07cM,共包含88个SNP和2个SSR。利用生物信息学工具,对7个耐高温QTL区间进行基因注释,共获得535个基因,KEGG富集和GO功能分类分析结果显示:代谢调控、信号转导、细胞过程通路占据了相当大的比例,说明大菱鲆高温胁迫过程中发生着生理生化自平衡过程,本研究结果也说明通过QTL定位对于功能基因挖掘和分析具有可靠的科学意义。2.本章采用Real-time PCR对上一章中已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的9个候选基因在不同温度胁迫下肝脏、鳃、脾、皮肤四个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14℃为对照组,20℃、23℃、25℃和28℃为实验组,进行数据分析。结果表明,其中四个基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)最具分析价值,这四种基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在四个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾、皮肤组织中20℃时急剧上升并达到峰值且差异显著(P<0.05);在鳃组织中23℃时达峰值,差异显著(P<0.05)。p53在四个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28℃时表达量急剧升高达到峰值且差异显著(P<0.05),猜测是由于组织严重受损,细胞大量凋亡导致。ZNF469和MAGI2在四个组织中均在20℃时大量表达,并远高于其他温度,认为两者可以作为大菱鲆高温胁迫应答的生物标志物。本研究发现在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。3.为进一步了解大菱鲆(Scophthalmus maximus)p53基因在高温胁迫应激响应中的作用,本研究通过RT-PCR及RACE技术扩增得到Sm-p53基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR检测Sm-p53 mRNA的组织表达及在慢性升温过程中的5个温度点(14℃、20℃、23℃、25℃、28℃)的表达特性,并通过Western Blot检测慢性升温实验中SM-P53蛋白的表达特性。结果显示:Sm-p53基因的cDNA全长2928bp,开放阅读框1146bp,编码381个氨基酸,编码蛋白等电点为6.73,分子量为42.77kDa。Sm-p53编码氨基酸序列有典型的DNA结合结构域(DNA-binding domain)和四聚化结构域(tetramerizationg domain)。Sm-p53编码氨基酸序列的同源性分析表明,鱼类p53基因聚为一支,大菱鲆与牙鲆亲缘关系最近。实时荧光定量检测表明,Sm-p53基因在肝脏中表达量最高,其次是鳃,显著高于肌肉组织(P<0.05);在慢性升温实验中Sm-p53基因的表达量总体呈现为随温度升高先上升后下降;Western Blot结果表明在慢性升温过程中Sm-P53蛋白的表达量随温度上升呈先升高后下降的趋势,并在23℃时表达量最高,在对照组14℃中表达量最低。研究结果表明,Sm-p53基因与大菱鲆热应激响应密切相关,在机体抗逆反应中发挥重要作用,为阐明Sm-p53基因在大菱鲆参与机体应激响应的分子机理提供理论依据。上述实验结果表明Sm-p53基因在响应大菱鲆热应激的过程中具有重要意义。综上所述,本研究在大菱鲆耐高温遗传连锁图谱中通过QTL定位筛选到与耐温性状相关的关键基因进行验证实验,并对其中的一个关键基因Sm-p53进行克隆、分析以及功能验证。以期揭示鱼类在高温胁迫下应激响应的分子机理,为进一步指导耐高温家系的选育奠定基础。