研究背景恶性肿瘤对人类的威胁日益突出,探求有效的早期诊断及治疗方法已成为当前医学领域中重大的研究课题,也是基础与临床医学研究的热点方向。肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞存在巨大差异,在肿瘤演变及生长过程中被稳定复制的一些重要的驱动突变,可作为一种新的生物标志物,对肿瘤的诊断以及预后判断将提供重要信息。检测这类驱动突变的主要临床意义包括：1.通过从肿瘤患者外周血及其他体液,或者穿刺组织中检出肿瘤源性的突变基因,提供早期诊断信息；2.监测患者治疗后(手术、放化疗)的肿瘤复发情况；3.根据肿瘤组织的突变信息进行分子分型,为疾病的预后、靶向药物的选择提供依据。BRAF基因编码蛋白是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路中的一种丝/苏氨酸特异性激酶,是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子。BRAF基因V600E是该基因的热点突变(约90%),表现为T变为A,突变结果导致其编码的谷氨酸(glutamic acid)由缬氨酸(valine)取代(V600E)。鉴于BRAF及MAPK通路对肿瘤发生发展的重要作用,BRAF基因的生物学行为和临床意义成了近年的研究热点。研究结果表明,BRAF V600E突变是区分遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)区分散发性结直肠癌的初筛指标之一。在结直肠癌患者的靶向治疗中发现,携带有BRAF V600E突变是患者对EGFR单抗药物(西妥昔单抗、帕尼单抗)的疗效不佳的生物学指标,同时也是预后不良的一个重要标志。在毛细胞白血病(Hairy-Cell Leukemia)肿瘤细胞的测序发现,肿瘤细胞全携带有BRAF V600E突变,这提示BRAF V600E很可能是毛细胞白血病致病的一个重要机制,同时也成为该病的一个新型的特异性诊断标志物,亦为该病BRAF靶向治疗提供新方向。临床试验显示,相对于传统抗恶性黑素瘤的药物氮烯咪胺,Vemurafenib(PLX4032)组在携有BRAF V600E的突变的晚期恶黑患者中显示出极佳的疗效,可大大提高晚期恶性黑色素瘤患者的反应率、无进展生存期与总生存期,被誉为近30年恶性黑素瘤治疗最大的研究突破。除此以外,在多种人类恶性肿瘤中,如肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF基因突变,这提示BRAF的分子分型不仅可成为肿瘤诊断的生物标志物,同时亦可能作为今后这类肿瘤亚型靶向药物疗效预测的新标志。实体肿瘤细胞往往混杂于正常的体细胞中,这为突变基因的检测带来挑战,如何敏感特异地检测低水平的肿瘤突变基因,是临床实验诊断学发展的新要求。研究目的立足于低水平肿瘤突变基因的电化学检测方法研究,初步建立一种结直肠癌细胞BRAF V600E突变基因的检测方法。该方法主要结合等位基因特异性扩增及酶促反应电化学传感的原理,实现对较低水平肿瘤BRAF V600E突变基因的检测。通过与Sanger测序及琼脂糖电泳的方法比较,比较该方法的敏感性及特异性,为低水平肿瘤基因突变的电化学检测提供新思路。研究方法1.利用等位基因特异性扩增技术检测人结直肠癌细胞系BRAF基因V600E突变1.1提取两株大肠腺癌SW480及HT29细胞的基因组DNA、设计引物扩增BRAF基因第15外显子,通过测序观察它们BRAF15外显子的突变情况。1.2根据人GeneBank公布序列及BRAF V600E突变位点,利用Primer Premier5.0软件设计等位基因特异性扩增引物,优化条件后,分别对两株细胞系的DNA进行等位基因特异性扩增,琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。2.酶促电化学传感方法检测BRAF V600E等位基因特异性扩增产物2.1利用生物素化的dCTP搀合至聚合链酶反应产物。探讨不同比例的biotin-dCTP对扩增产物的影响,据第一部分实验优化好的条件进行扩增,琼脂糖凝胶电泳对DNA扩增产物进行分离、鉴定,并选择理想biotin-dCTP的添加比例。2.2利用超滤离心管对PCR产物进行纯化。2.3金磁纳米颗粒进行扫描电镜及透射电镜扫描,观察粒子的结构性质。利用交流阻抗及循环伏安法对各个步骤的金磁性纳米微粒复合物进行表征。2.4丝网印刷碳电极的重现性实验。2.5对突变DNA模板的进行倍比稀释。2.6利用碱性磷酸酶标记后,通过金磁微粒磁性分离,最后在丝网印刷碳电极上检测电流信号。2.7对倍比稀释的V600E突变模板分别进行BRAF15外显子扩增后Sanger测序、酶联电化学传感方法检测等位基因特异性扩增产物以及琼脂糖凝胶电泳检测等位基因特异性扩增产物方法,进行敏感性及特异性比较。实验结果1.SW480及HT29两株细胞经扩增后测序证实分别为BRAF野生BRAF V600E杂合突变。设计一对等位基因特异性扩增引物,在优化条件下分别对两株大肠肿瘤细胞系基因组DNA进行扩增,结果显示本方法能成功扩增出携带有BRAFV600E突变的HT29细胞系目的条带,而BRAF基因V600E野生的SW480则扩增不能2.随着biotin-dCTP的比例的增加,扩增产物的分子量随之增大,而产物条带亮度却渐变暗,表明扩增效率随之逐渐下降。为达到较高的标记量,同时不明显影响扩增效率,我们选取50%的biotin-dCTP比例作为酶标实验的使用量。3.利用冷场发生扫描电子显微镜及透射电镜对金磁纳米微粒进行表征,其大小约数十纳米,均匀分布。交流阻抗及循环伏安法对各步骤的金磁微粒复合物进行表征,结果符合实验设想。4.四个同一批次的丝网印刷电极的在同-[Fe(CN)6]4-/3-溶液扫描,氧化峰电流RSD为4.8%,表明电极间的重现性较理想。5.对不同比例的突变模板进行BRAF基因V600E突变的等位基因特异性扩增产物进行酶标后,进行差分脉冲伏安法扫描。结果表明随着突变模板比例的增加,酶促反应产物(抗坏血酸)的氧化峰电流(0.25V)逐渐增大,而酶促反应底物(抗坏血酸-2-磷酸三钠)的氧化峰电流(0.75V)却逐渐减少,表明酶促反应的进行情况与BRAF V600E突变基因的增加有正关系。阈值根据Vthreshold value=Vnegative+3Vnegative SD的方法得出,突变基因的检测限为0.8%(0.024ng/ul),在突变比例为25%-3.1%时,氧化峰电流与突变核酸比例时成线性关系,相关系数为0.978。6.不同比例BRAF15外显子扩增后测序结果表明,普通PCR后测序突变基因的检测限为25%(7.5ng/ul)。7.对不同比例的突变模板进行V600E突变的等位基因PCR。扩增产物用传统琼脂糖电泳检测,结果显示监测限为6.3%(1.89ng/ul)。结论1.建立了可选择性扩增BRAF基因V600E突变的等位基因特异性扩增方法。该方法能成功扩增出携带有BRAF V600E突变的HT29细胞模板,而BRAF基因V600E野生的SW480则扩增不能。2.基于PCR-电化学传感技术联用的思路,利用酶标等位基因特异性扩增产物的方法,通过金磁纳米微粒磁性分离,最后在丝网印刷碳电极上检测电流信号的方法,构建了一种检测BRAF基因V600E突变的酶促电化学检测方法。由于本方法结合了等位基因特异性扩增的特异性高、数量扩增以及酶标信号放大的优点,与测序(检测限25%)及电泳法(检测限6.3%)相比,在BRAF V600E的突变检测中具有较高的灵敏度(检测限0.8%)。此外,检测电极使用的是可抛式的丝网印刷电极,使得检测样本量大大减少,同时得检测反应变得简便快捷。本方法结合了PCR与电化学传感技术的优点,在微量BRAF V600E突变基因检测以及实验室电化学芯片的研制具有一定理论意义和潜在的实际应用价值。