研究背景：　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南方地区发病率较高的肿瘤之一，其病因尚未完全明确，可能与EBV感染、环境及遗传等因素有关。放射治疗仍是治疗鼻咽癌患者的主要治疗手段，对于早期患者，单纯放疗能够取得较好的疗效，其5年生存率可达90％以上;但对于中晚期患者，单纯应用放射治疗效果欠佳，局部复发和远处转移仍是限制鼻咽癌疗效的主要因素。因此，探索及阐明影响鼻咽癌局部复发和远处转移的可能机制，寻找有效的分子靶点，有助于丰富鼻咽癌综合治疗的策略，提高鼻咽癌患者疗效，改善预后以及延长患者的生存期。　　转录生长因子β（Transforming growth factor beta，TGFβ）是一类多功能的多肽类生长因子超家族，广泛地存在于肿瘤微环境中，对肿瘤细胞的生长起着双向调控作用。已有研究证实，在鼻咽癌中存在TGFβ1的自分泌现象，而TGFβ1的水平增高可能与放射治疗效果不佳，肿瘤出现复发及转移，预后不良等密切有关。TGFβ1发挥生物学效应时首先与膜表面的TβRⅠ、Ⅱ等受体结合，通过活化下游的经典Smad通路或非Smad通路，进而调控靶基因的转录。TGFβ信号转导通路的异常被认为与肿瘤的发生、发展及转移等密切相关。而目前较少有研究对TGFβ1影响鼻咽癌细胞株的恶性生物学行为的机制进行探索，其下游信号通路的活化情况亦尚不明确。　　蛋白的糖基化是一种重要的翻译后修饰，影响着细胞生长、分化以及肿瘤的转移。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)是位于高尔基体的一种重要的糖基转移酶，可催化形成多种糖蛋白（如EGFR、TβR、NGFR等）的N-糖链β-1，6分支，而后者被证明是多种恶性肿瘤发生侵袭及转移的关键因素之一。有研究指出，GnT-Ⅴ可通过对TβR蛋白的N-糖基化修饰使其锚定在细胞膜上，不易内吞，从而使细胞对TGFβ1刺激的敏感性增加。在肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均可检测到GnT-Ⅴ的过量表达，且与不良预后相关。本课题组在前期研究中发现，在鼻咽癌及小细胞肺癌中，下调GnT-Ⅴ的表达，能够明显抑制肿瘤的增殖及转移。苦马豆素(Swainsonine，SW)是一种a-甘露糖苷酶抑制剂，能够特异性地抑制肿瘤细胞膜表面上N-糖蛋白β-1，6分支的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长及转移。因此，探索N-糖基化修饰影响鼻咽癌细胞株恶性生物学的分子机制及下游信号通路的活化是本文的研究重点。通过本实验研究发现:TGFβ1及下游TGFβ/smad通路的持续活化是影响鼻咽癌恶性生物学行为的一个重要因素，而N-糖基化抑制可通过减少TβR的表达以及限制TGFβ/smad通路的活化而逆转鼻咽癌细胞株的恶性生物学行为，为丰富鼻咽癌综合治疗策略提供一定的实验基础。　　研究目的：　　在本实验中，利用鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2，探讨N-糖基化修饰对于TGFβ1介导的鼻咽癌细胞株增殖、侵袭及迁移等恶性生物学行为的影响及下游TGFβ/Smad通路的活化情况。希望通过本实验的研究，阐明N-糖基化修饰调控鼻咽癌细胞恶性生物学行为的分子机制，为N-糖基化抑制用于鼻咽癌的综合治疗提供一定的实验基础。　　研究方法　　1、慢病毒转染构建稳定下调Gnt-Ⅴ的鼻咽癌细胞株　　2、RNA提取和qRT-PCR检测相应细胞株中mRNA水平　　3、蛋白提取和免疫印迹(Western blot)检测相应细胞株中蛋白的表达　　4、凝集素实验(Lectin-Blot)检测总β-1，6分支的表达　　5、CCK-8增殖实验检测细胞的增殖能力　　6、克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力　　7、流式细胞术检测细胞凋亡情况　　8、划痕愈合实验检测细胞的迁移能力　　9、Transwell实验检测细胞的侵袭能力　　10、统计学分析　　研究结果：　　1、探索TGFβ1对鼻咽癌细胞株恶性生物学行为的影响　　细胞功能学实验结果显示:TGFβ1能够显著促进鼻咽癌细胞株(CNE-1和CNE-2)的增殖及克隆形成，促进其发生侵袭及转移，对细胞的凋亡并无明显影响。　　2、探索N-糖基化抑制剂SW对于TGFβ1介导的鼻咽癌细胞株恶性生物学行为的逆转作用　　应用N-糖基化抑制剂SW对鼻咽癌细胞株进行预处理24h，再加入TGFβ1刺激细胞，细胞功能学结果显示:相比单独加入TGFβ1，SW联合TGFβ1能够明显抑制鼻咽癌细胞株（CNE-1和CNE-2）的增殖，减少其克隆形成，抑制其发生侵袭及转移，但对细胞的凋亡并无明显影响。　　3、SW对于TβR及TGFβ1下游信号通路的影响　　RT-PCR及蛋白印迹结果显示:SW能够显著减少TβR1、TβR2mRNA及蛋白的表达，减少Smad2、3总蛋白的表达并抑制其发生磷酸化，从而抑制TGFβ/Smad通路的活化。　　凝集素实验结果显示:TGFβ1使细胞总β-1，6分支的表达增加，而SW则明显减少细胞总β-1，6分支的表达。　　4、慢病毒构建稳定低表达GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞株及检测干扰效果　　慢病毒为载体构建稳定低表达GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2，RT-PCR及蛋白印迹技术验证其下调效果。　　5、稳定低表达GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞株中TβR的表达及TGFβ/Smad信号通路的活化情况　　RT-PCR及蛋白印迹结果显示:在慢病毒转染下调GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞株中，TβR1、TβR2mRNA及蛋白的表达明显减少，Smad2、3总蛋白的表达及其磷酸化水平均受到抑制，提示TGFβ/Smad通路的活化受到一定的抑制。　　研究结论：　　1、TGFβ1促进鼻咽癌细胞株的增殖、侵袭及迁移，但对细胞凋亡无明显影响。　　2、SW可通过下调TβR受体蛋白的表达，限制TGFβ/Smad通路的活化，从而抑制TGFβ1介导的鼻咽癌细胞株恶行生物学行为。　　3、靶向GnT-Ⅴ的shRNA慢病毒转染可显著下调GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表达。　　4、下调GnT-Ⅴ可显著减少TβR的表达及抑制TGFβ/Smad通路的活化。