固有无序蛋白(intrinsically disordered protein,IDP)是一类在天然状态下没有稳定的二级或三级结构,但仍具有生理活性的蛋白质。在一定条件下,IDP无序部分的构象会发生变化,从而发挥分子伴侣、位点修饰、分子效应器、分子组装、解毒等多种功能,在分子调控网络中占据核心地位。研究发现,许多IDP在逆境胁迫下都具有可变剪接(Alternative Splicing,AS)现象,说明IDP的可变剪接与响应逆境胁迫的生理过程有着潜在的联系。可变剪接是真核生物调控基因表达的一种重要方式,也是产生功能多样化蛋白质的基础,在调节酶的活性、蛋白质的亚细胞定位和翻译后修饰过程中扮演重要角色。所以植物IDP通过可变剪接参与抗逆反应的机制值得深入研究。胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant,LEA)是IDP中与植物抗逆功能密切相关的一类蛋白,可以被干旱、高温、高盐等非生物胁迫诱导表达,能够维持胁迫下蛋白的活性、抑制蛋白聚集、稳定蛋白构象及保护膜结构等。大豆PM18属于LEA3组蛋白,在NCBI数据库中存在两个转录本(PM18α和PM18β),本实验室在研究大豆胚根热稳定蛋白时意外鉴定到了PM18α和PM18β蛋白的特征肽段,从而证实了在大豆中存在着这两个转录本的蛋白产物。但是PM18基因的抗逆机制与可变剪接的关系还未见报道。本文首先对大豆PM18两个转录本进行生物信息学分析。ANCHOR、PONDR网站预测PM18α和PM18β均为固有无序蛋白,在N端和C端有极高的无序性,在差异氨基酸位置处PM18β的功能区域比PM18α更短,但PM18β靠近C端的功能区域更长;PREDICT PROTEIN、SMART软件预测PM18α在C端表现为3个较长螺旋且功能结合位点更长,而PM18β则为两个长螺旋和短的功能结合位点;BaCeILo、SignalP4.1预测两者定位于细胞核或细胞质,且均无信号肽;通过SWISS-MODEL建模发现PM18α具有三个长的螺旋结构域,而PM18β则只有两个螺旋结构域。为比较PM18α和PM18β的结构功能差异,我们构建了PM18α和PM18β原核表达载体,通过亲和层析纯化得到了目的蛋白。圆二色谱结果显示两者在水溶液中均呈现典型的无规卷曲结构,说明均为无序蛋白。在25%的TFE及1mM的SDS诱导剂存在下,两者均可以形成80%以上的α螺旋结构;在大分子拥挤剂PEG存在时,PM18α具有更强的形成α螺旋结构的趋势,而PM18β蛋白构象则具有向β折叠结构转变的趋势。在保护酶活性方面,1.8μM的PM18α能够使冻融胁迫下乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)的残留酶活达到70%以上,而同浓度PM18β保护下的LDH酶残留酶活达到90%左右。所以在保护冻融胁迫下LDH酶活性方面,PM18β比PM18α蛋白更强。55℃高温胁迫下,PM18(1.8μM)蛋白对LDH酶有一定的保护作用。相同条件下,加入80g/L的大分子拥挤剂Dextran时PM18蛋白对LDH酶活无明显保护作用;而加入PEG时两者都表现出保护作用降低的现象;但加入Ficoll时,PM18α对LDH酶有明显的保护作用,而PM18β无保护作用,说明不同大分子拥挤环境对PM18保护LDH酶活能力的影响是不同的。综合来看,两者在体外结构和功能上存在一定差异。由于固有无序蛋白常在分子网络中与不同结构的靶蛋白发生结合,参与不同生理过程,所以我们对PM18蛋白进行了互作蛋白筛选,本实验室前期已经筛选到6个与PM18β互作的蛋白,本文进一步对PM18α的互作蛋白进行筛选。通过酵母双杂交系统,在大豆根叶混合cDNA文库中共筛选到30个阳性克隆,回转验证后得到22个阳性克隆,对其基因序列进行测序比对,最终得到了11个阅读框正确的候选互作蛋白。11个候选互作蛋白中有4个与PM18β的互作蛋白一致或属于同一家族,PM18α-1、PM18α-8同属电压依赖型阴离子通道蛋白家族(Voltage-dependent anion channel,VDAC);PM18α-17是质体蓝素家族蛋白;PM18α-27与PM18β-9同属MYB转录因子家族;PM18α蛋白还与甲硫氨肽酶家族、组蛋白H2A、HSP40家族、AP1GI等蛋白家族互作,所以PM18α和PM18β可能与不同的蛋白发生相互作用。综上所述,PM18基因可变剪接产生的两个转录本在体外结构和功能有一定差异,它们可以与不同的蛋白发生相互作用,从而参与到不同的调控途径,这为进一步研究PM18基因的抗逆机制提供了新思路。