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研究背景:低氧性肺动脉高压表现为持久的肺血管收缩及显著的肺血管重构,引起肺动脉压力明显增加,最终导致致命性的右心衰竭。以血管平滑肌细胞增殖及内皮细胞损伤为核心的细胞增殖/凋亡失衡是血管重构的关键因素。持续的低氧暴露可促进平滑肌细胞增殖,促进血管重构。血管内的平滑肌细胞同时也受其他细胞调控,内皮细胞位于血管壁的内层,调节平滑肌细胞增殖、血小板黏附和聚集、内源性舒张物质分泌等。低氧可诱导内皮细胞凋亡,激活NF-κB途经介导的黏附分子及促炎细胞因子表达,招募炎性细胞浸润。同时,舒张血管物质生成减少,收缩性物质分泌增多,进一步加重血管重构。线粒体不仅作为能量工厂,更是细胞内各种信号汇集传导的中转站,广泛参与细胞自噬,炎症应答,增殖/凋亡等生物进程。低氧时内皮细胞与平滑肌细胞均存在线粒体结构和功能的异常改变。低氧可促进平滑肌细胞糖酵解,抑制线粒体的有氧氧化。线粒体钙水平降低是抑制线粒体有氧氧化的主要因素之一,包括丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶和ATP合酶等线粒体呼吸相关酶的活性依赖Ca2+的参与。因此,线粒体钙的减少可抑制氧化呼吸,并伴随线粒体氧自由基的失衡。而线粒体功能异常可激活下游增殖信号通路如HIF-1α,NFATc及Kv1.5的下调,从而促进细胞增殖。在血管重构的另一关键细胞中,低氧可诱导内皮线粒体嵴断裂,肿胀,也可激活线粒体自噬,损伤线粒体生物合成,从而激活NF-κB途径介导的炎性分子表达并抑制NO生成,促进收缩性因子的分泌。内质网-线粒体相关膜（Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum membranes/mitochondria-associated membranes,MAMs）是内质网与线粒体膜之间接触的区域,广泛参与线粒体功能调节。MAMs通过位于内质网膜和线粒体外膜蛋白之间的连接作用促进膜的接触。IP3Rs/GRP75/VDAC1是内质网-线粒体蛋白连接子之一,介导内质网-线粒体钙转移,影响线粒体功能。同时,IP3Rs可被MAMs界面分子伴侣蛋白结合或激酶Akt磷酸化,影响钙的释放。因此,内质网-线粒体钙转移受MAMs形成及IP3Rs/Grp75/VDAC1钙转移轴相关修饰信号的共同调节。除调控胞内钙转移信号外,众多生物进程中的核心蛋白表达于MAMs界面,使得MAMs广泛参与脂类代谢,自噬,线粒体分裂,免疫应答,凋亡和内质网应激等。一系列研究表明,肝脏及脑组织蛋白组学检测发现MAMs界面表达上千种蛋白和数十种激酶及磷酸酶,病理条件下,此界面蛋白表达、修饰化水平及蛋白通路等发生显著转变,参与疾病的发生与发展。最近报道,沉默Nogo-B的表达可增强低氧时MAMs的形成,介导内质网-线粒体钙转移,促进平滑肌细胞凋亡,改善低氧性肺动脉高压表型。Nogo-B受体（Nogo-B receptor,NgBR）在先天性肺动脉高压模型中表达降低,通过ROS的生成介导平滑肌细胞增殖,其相关机制有待进一步明确。同时,低氧时内皮细胞MAMs的改变及其作用尚不清楚。因此,本研究拟以血管重构的关键靶点内皮细胞和平滑肌细胞为研究对象,探讨低氧时MAMs形成和界面蛋白通路的转变及其作用,明确介导MAMs改变的调控机制,以加深对低氧诱导平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤的理解。方法:1.建立低氧诱导的平滑肌细胞增殖模型,通过MAMs组成蛋白WB及电镜检测明确低氧时MAMs的形成改变。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞,促进MAMs形成,通过线粒体呼吸、增殖/凋亡等蛋白检测探讨其对低氧时平滑肌细胞增殖/凋亡的影响。2.获取足够的平滑肌细胞MAMs界面蛋白,通过蛋白组学检测分析低氧时MAMs蛋白组学改变表征及其在内质网-线粒体钙转移中的作用。3.探讨Nogo-B/NgBR对平滑肌细胞MAMs形成和内质网-线粒体钙转移通路的调控作用。利用低氧性肺动脉高压自然逆转和体外低氧-复氧模型检测平滑肌细胞Nogo-B及NgBR表达。过表达和抑表达Nogo-B或NgBR后,WB检测MAMs组成蛋白及内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路。通过氧耗率测定,激光共聚焦,WB等检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及线粒体氧自由基等线粒体功能指标和细胞增殖水平。4.建立低氧诱导的内皮细胞损伤模型,通过MAMs组成蛋白WB检测、内质网-线粒体标志蛋白IF检测明确低氧时内皮细胞MAMs的形成改变。下调MAMs组成蛋白PACS-2,IP3R1表达以抑制MAMs形成,探讨其对低氧诱导内皮细胞损伤的保护作用。检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及氧自由基等线粒体功能指标,检测流式细胞,PARP,PCNA及上清LDH酶活性等凋亡指标,检测炎性分子蛋白及mRNA表达,并检测eNOS-NO通路。结果:1.WB提示低氧时平滑肌细胞增殖相关蛋白PCNA表达增加,而凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达降低。同时,IF显示Edu标记的阳性细胞百分比增加。低氧时MAMs组成蛋白表达降低,电镜显示内质网与线粒体膜之间的最短距离增加,反映MAMs的形成受到破坏。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞后,线粒体呼吸增强,低氧时pAMPKα,PCNA增加,剪切型PARP比值减少。2.GO分析提示,低氧时MAMs界面差异蛋白主要定位于内质网,具有结合及催化活性,参与信号处理,生物学调控,刺激应答及蛋白定位等生物进程。富集分析发现差异蛋白主要与酰胺合成,抑制细胞分化有关。KEGG通路富集分析表明低氧时内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显著激活。Nogo-B表达于MAMs界面,且在低氧时增加。3.IF提示低氧诱导的血管重构中平滑肌Nogo-B蛋白表达增加,NgBR降低,随着复氧后结构改建的自然逆转Nogo-B表达降低,NgBR增加。体外平滑肌细胞低氧时,Nogo-B在全细胞匀浆水平中表达未改变,WB及免疫沉淀作用结果表明低氧时MAMs界面Nogo-B表达增加。而NgBR在体外低氧的平滑肌细胞中表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR能抑制MAMs形成,表现为MAMs组成蛋白表达下调或内质网-线粒体标记荧光共区域指数降低,电镜发现内质网膜与线粒体外膜之间的最短距离增加。同时,WB提示MAMs内质网-线粒体钙转移通路pAkt-IP3R3激活。Rhod-2 am检测发现线粒体钙水平降低,而耗氧率测定表明线粒体呼吸受到抑制。同时,IF提示线粒体膜电位增加,线粒体氧自由基减少,HIF-1α入核的阳性细胞百分比增加。MTT,PCNA、Cyclin D1蛋白或Edu标记阳性百分比检测表明过表达Nogo-B或抑表达NgBR能在常氧条件下促进平滑肌细胞增殖。抑表达Nogo-B或过表达NgBR能逆转上述效应,抑制低氧诱导的平滑肌细胞增殖。4.WB及IF提示低氧时HPAEC及HUVEC MAMs组成蛋白表达增加,内质网-线粒体标记荧光共区域指数增加。利用siRNA下调MAMs组成蛋白PACS-2或IP3R1以抑制MAMs形成。干预MAMs后,IF提示低氧时线粒体钙信号降低,线粒体膜电位值增加,ROS减少。氧耗率测定显示基础呼吸增加,ATP生成增多。干预MAMs后,流式细胞检测提示低氧时增加的早期凋亡、晚期凋亡和总的凋亡细胞百分比降低。WB表明,剪切型PARP比值降低,PCNA增加。细胞培养上清LDH活性降低。干预MAMs后,WB发现低氧诱导的NF-κB磷酸化受到显著抑制。Realtime PCR,WB及Elisa检测提示促炎分子ICAM-1,VCAM-1,E-selectin,MCP-1,IL-6,IL-1β表达降低。干预MAMs后,WB及Elisa检测表明低氧抑制的eNOS S1177磷酸化增加,eNOS活性增强。细胞上清中NO含量增多。结论:1.低氧可诱导平滑肌细胞增殖,MAMs形成减少。促进MAMs形成可促进低氧时平滑肌细胞凋亡和抑制增殖。2.低氧时MAMs界面内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显著激活,Nogo-B蛋白表达增加,从而参与内质网应激应答,神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇等鞘脂代谢及内质网-线粒体钙转移信号调控,影响平滑肌细胞增殖。3.Nogo-B与NgBR蛋白表达在低氧诱导的平滑肌细胞增殖中出现分离。低氧时,Nogo-B于MAMs界面分布增多,在全细胞水平上未改变。低氧时NgBR表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR可抑制MAMs形成和激活MAMs内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路,降低线粒体钙水平,损害线粒体功能,促进平滑肌细胞增殖。4.低氧时内皮细胞MAMs形成增多。破坏MAMs形成可减少低氧引起的线粒体功能损害,抑制细胞凋亡和炎症应答,并增加NO生成。上述研究表明MAMs有望成为干预或防治低氧性肺动脉高压的有效靶点。