研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer)是最常见的恶性肿瘤之一,其世界范围内的发病率和死亡率分别居肿瘤第三位和第四位,长期威胁着人类生命健康。近二十多年来,由于经济的快速发展及生活方式的西化,我国的结直肠癌发病率呈逐年上升趋势。虽然早期结直肠癌患者经过手术治疗,5年生存率高达90%以上,然而在我国临床上约40%的结直肠癌患者在确诊之初已出现微转移,而转移正是导致患者死亡的主要原因。结直肠癌严重降低患者的生活质量和生存期,同时也给患者和社会带来了沉重的经济负担。结直肠癌的发生及转移是一个多基因参与的多步骤、多阶段的复杂生物过程。包括肠粘膜上皮细胞在多种致瘤因素作用下失去对细胞正常生长的调控,导致细胞周期紊乱,呈无限增殖状态进而导致癌症的发生;癌细胞从肿瘤的原发部位逃逸,进入周围基质,从而进入血液循环系统及淋巴系统,粘附在内皮细胞壁的肿瘤细胞再向血管外迁移、远处浸润、血管增生,最终形成转移灶。目前,关于结直肠癌的发生及转移的分子基础和机制尚不完全清楚。这个过程中伴有众多癌基因的激活和抑癌基因的失活等突变,目前已有多达上百种基因被报道参与结直肠癌的转移过程。因此,需要深入研究结直肠癌的发生及转移的分子机制,寻找有效、敏感且特异的结直肠癌相关分子标志物,以期对结直肠癌转移进行预警,做到早期诊断、早期干预并提高预后,带来显著的临床价值和社会效益。LASP2(LIM and SH3 protein 2)基因定位于人类染色体10p12.31,其编码的LASP2蛋白由1014个氨基酸组成,和LASP1(LIM and SH3 protein 1)—样同属于伴肌动蛋白家族,且二者结构上氨基末端含有LIM(Lin-1,Isl-1 and Mec-3)功能域,羧基末端包含一个Src同源结构域3(SH3)。而LASP1作为细胞骨架的重要结构蛋白,与细胞运动密切相关,目前已有许多研究报道LASP1与转移性乳腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤的发生、进展密切相关。我们课题组的前期研究已经证实LASP1在结直肠癌中表达显著上调,并能促进结直肠癌的增殖及转移。LASP2在结构上与LASP1高度相似,那么其在肿瘤细胞中是否也具有相似的功能就成为了我们关注的研究方向。然而,目前关于LASP2的研究极少,仅有的几篇研究报道了其与细胞粘附、运动等功能相关,且在LASP1存在时LASP2与细胞骨架蛋白之间的相互作用会减弱。本课题拟通过检测LASP2在结直肠癌中的表达情况,分析其表达与临床病理参数之间的相关性,并通过体外实验,研究LASP2在结直肠癌发生、发展和转移过程中的作用及相关分子机制。为临床结直肠癌的早期诊断分期及预后预测提供新的分子标志物。研究方法一、LASP2在结直肠细胞及组织中的表达鉴定1.提取结直肠癌细胞系mRNA及蛋白质,qPCR检测LASP2的mRNA相对表达量,Western blot检测LASP2蛋白表达量;2.取89例临床确诊结直肠癌患者的手术切除组织蜡块以及72例正常结直肠粘膜上皮的蜡块,利用免疫组织化学(IHC)检测LASP2在其中的表达情况。二、LASP2的表达定位与临床病理参数的相关性分析利用Chi-square检验、Kaplan-Meier生存分析及多因素分析等统计方法分析LASP2的表达定位与肿瘤分期、转移及临床预后等相关临床病理参数之间的关系。三、LASP2在结直肠癌增殖及转移过程中的作用1.构建LASP2过表达载体,转染LASP2低表达结直肠癌细胞系,并利用Western blot及qPCR鉴定过表达效果,通过CCK8、transwell实验检测转染后细胞的增殖及迁移能力;2.合成siRNA干扰LASP2表达,转染LASP2高表达结直肠癌细胞系,鉴定干扰效果后利用CCK8、transwell实验检测干扰LASP2表达对结直肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响。四、LASP2调控结直肠癌增殖转移的分子机制1.利用Western blot检测LASP2表达干扰后信号通路激活情况及EMT相关标志物的变化;2.利用相关通路抑制剂证实LASP2通过特异性信号通路调控结直肠的增殖及转移。五、LASP2与LASP1在结直肠癌中表达的相关性1.利用qPCR检测LASP1、LASP2在结直肠癌细胞及组织中的表达;2.通过转染LASP1的过表达载体及干扰siRNA,利用Western blot检测LASP1及LASP2的表达;3.利用IHC检测在LASP1高表达及低表达病例中的LASP2表达情况。结果一、LASP2在结直肠细胞及组织中的表达鉴定1.结直肠癌细胞系中LASP2的表达qPCR结果显示LASP2在人结直肠癌细胞株HT29、RKO、SW480中低表达,而在HCT116、SW620、SW480/M5中高表达,western blot也揭示了类似的结果,综合二者结果,我们选择SW480作为LASP2低表达细胞株,SW620及HCT116作为LASP2高表达细胞株进行后续实验。2.结直肠癌组织中LASP2的表达IHC结果表明LASP2在正常结直肠粘膜上皮中的过表达率为68%(49/72),而在结直肠癌标本中的过表达率相对较低50.6%(45/89)(p=0.025)。3.LASP2的表达和临床病理参数之间的关系LASP2的表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、T分期无显著性差异(p>0.05);而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移(N)、AJCC分期相关。分化程度越高,LASP2高表达率越高(p=0.023);N分期越高,LASP2高表达率越低(p=0.026);AJCC分期越晚,LASP2高表达率越低(p=0.015)。多因素分析显示LASP2过表达并不能作为预测患者预后的独立指标(p=0.177),但单因素分析表明LASP2过表达同肿瘤分化程度、N分期一样,与结直肠癌患者预后密切相关(p=0.024)。4.LASP2的表达和患者临床预后的相关性分析Kaplan-Meier生存分析结果表明在所有89例结直肠癌患者中,LASP2高表达的患者生存率显著高于LASP2低表达的患者(logrank=5.490,p=0.019);在结直肠癌浸润深度分期T3及T4病例中,LASP2高表达患者的生存期同样显著高于 LASP2 低表达组(logrank=4.384,p=0.036)。二、LASP2的表达对于结直肠癌细胞生物学特性的影响1.LASP2载体瞬时转染过表达对结直肠癌细胞增殖及迁移的作用1.1.LASP2瞬转过表达效率验证利用阳离子脂质体法将LASP2质粒及空载分别转染SW480细胞,western blot结果表明LASP2质粒组显著过表达LASP2(p<0.01)。1.2.LASP2过表达对结直肠癌细胞增殖及迁移能力的影响CCK8实验表明在SW480细胞中,LASP2质粒组的增殖速度低于空载组,时间与分组之间交互效应显著,差异具有统计学意义(p<0.05)。结果说明LASP2过表达能够抑制结直肠癌细胞的增殖能力。Transwell实验结果显示在SW480细胞中,LASP2载体组的细胞迁移过tranwswell小室的数量明显少于空载组(p<0.01),说明LASP2过表达能够抑制结直肠癌细胞的迁移能力。2.LASP2瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响2.1.LASP2瞬时沉默的效率验证选择前期已经验证干扰LASP2表达最有效的siRNA与对照片段分别瞬时转染HCT116及SW620细胞,western blot实验显示LASP2干扰组低表达 LASP2 明显(p<0.05)。2.2.LASP2瞬时沉默对于结直肠癌细胞的增殖及迁移的作用CCK8实验结果显示在HCT116和SW620细胞中,LASP2干扰组的生长速度高于对照组,生长时间与分组之间交互效应显著,差异具有统计学意义(p<0.05),结果说明干扰LASP2表达能够促进结直肠癌细胞的增殖。Transwell实验结果表明在HCT116和SW620细胞中,LASP2干扰组的细胞迁移过tranwswell小室的数量显著多于空载组(p<0.01),说明干扰LASP2表达能够促进结直肠癌细胞的迁移。三、LASP2调控结直肠癌增殖转移的分子机制1.干扰LASP2表达对JNK/p38 MAPK信号通路的影响将干扰LASP2表达的siRNA及对照组分别转染SW620细胞,western blot检测MAPK信号通路的相关蛋白表达,结果显示p38、SAPK/JNK、p44/42磷酸化水平显著提高,表明在结直肠癌细胞中LASP2的表达沉默后,JNK/p38 MAPK信号通路激活。2.干扰LASP2表达对EMT相关标志物的表达影响Western blot检测SW620的LASP2干扰组及对照组中EMT相关分子标志物的表达情况,结果显示LASP2干扰组中上皮标志物(ZO-1、E-cadherin、β-catenin)的表达显著降低,而间叶标志物(N-cadherin、vimentin)表达显著升高,说明干扰结直肠癌细胞中的LASP2表达可诱导其发生EMT。3.信号通路抑制剂对于LASP2介导的信号通路激活及结直肠癌生物学行为的逆转作用将JNK及p38特异性抑制剂处理转染了 LASP2干扰siRNA的结直肠癌细胞,检测p38、SAPK/JNK及EMT相关分子标志物的表达,结果显示抑制剂处理后,相关蛋白的表达较LASP2干扰组有明显的恢复;同时transwell实验结果显示抑制剂处理后的结直肠癌细胞迁移过transwell小室的细胞数较LASP2干扰组明显减少。说明JNK/p38 MAPK信号通路是LASP2调控结直肠癌细胞增殖和转移所必须的。四、LASP2与LASP1在结直肠癌中的表达相关性1.LASP2与LASP1在结直肠癌细胞系中的表达相关性提取结直肠癌细胞系mRNA,qPCR同时检测LASP2和LASP1在其中的相对表达量,结果显示在LASP1高表达的细胞中LASP2低表达。同时选取SW480转染LASP1干扰siRNA,选取SW620转染LASP1过表达质粒,利用western blot检测LASP1和LASP2的相对表达量,结果显示干扰LASP1表达后,LASP2表达上调,反之过表达LASP1后LASP2表达下调。提示LASP1能够反向调节LASP2的表达。2.LASP2与LASP1在结直肠癌组织中的表达相关性89例结直肠癌标本的免疫组化结果显示在LASP1高表达的结直肠癌组织中LASP2低表达,反之在LASP1低表达的结直肠癌组织中LASP2高表达(R=-0.390,p=0.013)。结论LASP2在结直肠癌细胞系及组织中低表达,具有抑制结直肠癌细胞增殖及转移的能力,并且与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、淋巴结转移(N)、AJCC分期以及临床预后等参数相关,是一个肿瘤患者分期及预后预测的潜在新型分子标志物。